A dispersão aprimorada por nanoplasmon, ou nPES, é uma alternativa simples e não invasiva à biópsia cirúrgica que pode pular etapas de purificação exósia demorada e intensiva em trabalho de parto, expandindo a aplicação de análise exosóbida para ambientes clínicos. Este ensaio nPES é um procedimento rápido para analisar biomarcadores específicos na membrana externa de exosóis que não requerem etapas separadas de isolamento e purificação. Só precisamos de uma amostra clínica muito pequena para este ensaio.
Portanto, este método pode expandir o uso de nPES para estudar modelos de mouse geneticamente modificados ou PDX. Há alguns passos neste protocolo que podem parecer assustadores. No entanto, com algumas corridas práticas, todos com habilidades básicas de laboratório molhado podem aprender a executar com sucesso o NPES.
Para iniciar o procedimento, combine 40 microliters de uma suspensão de nanorods de ouro funcionalizados neutrAvidin com 200 microliters de frio, pH sete salina tamponada com fosfato. Centrifugar a mistura a 8500 vezes g a quatro graus Celsius por 10 minutos, e remova o sobrenante. Repita este processo de lavagem mais duas vezes e, em seguida, resuspenja os nanorods em 40 microliters de PBS frio.
Em seguida, adicione 150 microliters de PBS frio e 10 microliters de uma solução de 0,5 miligramas por mililitro dos anticorpos biotinitados apropriados à suspensão. Misture a quatro graus Celsius por duas horas para obter nanorods de ouro conjugados com anticorpos. Lave os nanorods três vezes por centrifugação em porções de 200 microliter de PBS frio a 6500 vezes g a quatro graus Celsius por 10 minutos cada.
Depois, resuspenja os nanorods conjugados com anticorpos lavados em 200 microliters de PBS frio, e armazene-os a quatro graus Celsius por até 24 horas. Para começar a preparar o slide, diluir os anticorpos de captura exososome desejados para 025 miligramas por mililitro em PBS. Pipeta um microliter desta solução em cada poço de um slide tratado de proteína A/G apoiado com vidro de grau óptico.
Em seguida, transfira o slide para uma caixa umidificante para garantir que os poços não sequem durante a incubação. Incubar o slide a 37 graus Celsius por uma hora para imobilizar os anticorpos de captura. Em seguida, aspire a solução restante para remover anticorpos desvinculados.
Lave os poços adicionando e aspirando um microliter de PBS três vezes. Em seguida, carregue rapidamente cada poço com um microliter de tampão de bloqueio baseado em PBS, e incubar o slide a 37 graus Celsius por duas horas. Ao executar cerca de 15 amostras, devemos usar uma pipeta de canal único para carregar o buffer de bloqueio em 120 poços em menos de cinco minutos para evitar a evaporação do agente de bloqueio.
Comece a preparar uma solução de nanorods de ouro conjugados com anticorpos durante o bloqueio de slides. Cerca de 30 minutos antes de bloquear termina, descongele rapidamente amostras de plasma ou soro em um banho de água em temperatura ambiente. Vórtice as amostras descongeladas por 30 segundos para garantir que as suspensões sejam homogêneas.
Em seguida, centrifugar as amostras a 500 vezes g por 15 minutos para precipitar agregados proteicos e outros detritos. Transfira alíquotas de 10 microliter do supernascer para tubos frescos, e faça diluições um-para-um com PBS. Misture as amostras diluídas por vórtice suave ou inversão conforme apropriado.
Quando o bloqueio de slides estiver concluído, aspire o tampão de bloqueio e lave os poços três vezes com porções de um microliter de PBS. Carregue imediatamente as amostras nos poços com um microliter por poço e oito réplicas por amostra. Carregue padrões exossosome nos poços apropriados da mesma forma.
Incubar o slide por 12 a 18 horas em uma geladeira a quatro graus Celsius. Em seguida, aspire os poços, e lave cada poço uma vez com um microliter de PBS. Carregue um microliter da suspensão nanorod de ouro conjugado com anticorpos em cada poço, e incubar o slide a 37 graus Celsius por duas horas.
Depois, aspire a suspensão de nanorod e lave o slide em PBS complementado com 1%de polisorbato 20 por 10 minutos usando uma batedeira. Em seguida, aspire os poços e lave o escorregador em água desionizada por 10 minutos em uma batedeira giratória. Remova a água e deixe o slide secar no ar em uma placa de Petri limpa antes de levar o slide para o microscópio de campo escuro.
Configure um microscópio invertido equipado com um condensador de imersão a óleo de campo escuro, um objetivo de 4x e um estágio motorizado. Conecte o microscópio a um computador através de uma câmera digital e abra o software de imagem. Em seguida, coloque o deslizamento da amostra de cabeça para baixo no estágio do microscópio e aplique uma pequena gota de óleo de imersão onde a lente condensadora entra em contato com o slide.
Exibir a visualização através do microscópio no software de imagem. Ajuste o tempo de exposição em um poço de alto padrão de concentração para garantir que a imagem não fique saturada. Em seguida, abra a ferramenta para digitalizar imagens grandes e defina a ampliação objetiva em 10x.
Escolha fechar o obturador ativo durante o movimento do estágio e esperar 20 milissegundos antes de cada captura. Defina a sobreposição de costura para 20% e selecione a costura através do caminho ideal. Escolha criar uma imagem grande a partir da varredura.
Defina a câmera para se concentrar manualmente no início da varredura e habilite o foco passo a passo automático a cada 20 campos. Em seguida, escolha definir limites esquerdo, direito, superior e inferior para o campo de varredura de destino e definir a área de varredura movendo o estágio do microscópio para cada um dos limites desejados. Em seguida, ajuste o foco, o condensador e a iluminação da área para obter uma imagem clara e bem iluminada.
Nomeie o arquivo de imagem a ser criado e inicie a varredura. Quando terminar, abra a imagem e salve-a em 1/8 de escala. Abra o software de análise de imagens.
Em seguida, abra o menu Plugins, clique em DSM Scan, defina o número de colunas e linhas, defina porcentagem de tamanho de ressarbio para 25, defina o diâmetro do ponto, em pixels, para 190 a 200, defina a faixa de diâmetro para 32, e defina o diâmetro de incremento, em pixels, para oito. Defina os limites de DSM baixos e altos para zero e 62, a distância adjacente a 100 e o viés de subtração a zero. Execute o algoritmo DSM e salve os dados resultantes.
A técnica de análise DSM mostrou boa reprodutibilidade em amostras exóssa panc-1 diluídas serialmente variando de 0,24 a 1,2 microgramas por microliter. Observou-se forte correlação linear entre a resposta de dispersão dos nanorods de ouro e a concentração de proteínas exosóis. Observou-se diferença significativa na abundância de exosóis séricos que expressam o biomarcador associado ao câncer EphA2 entre pacientes com câncer de pâncreas e pacientes saudáveis.
A partir da adição do agente de bloqueio em diante, a tubulação rápida e precisa é crucial para evitar a evaporação das amostras, introduzindo contaminação cruzada e arranhando a superfície do slide. Após esse procedimento, realizamos análise estatística para investigar qualquer correlação entre a expressão do biomarcador exosômico de interesse e diferentes estágios da doença que está sendo estudado. Depois de estabelecer essa tecnologia, e nós somos capazes de encontrar biomarcadores exosômicos para cânceres de pâncreas em estágio inicial.
Atualmente, estamos expandindo essa descoberta para outros tipos de cânceres e doenças de infecção. Normalmente, as amostras manuseadas neste ensaio são amostras de pacientes ou amostras exóssias purificadas de linhas de células cancerosas, que necessitam de treinamento especial de segurança.
