The authors would like to thank Christina Ball&#225;zs, Hug Aubin and J&#246;rn H&#252;lsmann for the critical reading of the manuscript and excellent editorial assistance. Moreover, the authors thank Gisela Mueller for the technical assistance. The authors thank Particle Metrix GmbH for providing the funds covering the publication costs.

הערה: הניסויים שהוצגו בעבודה זו אושרו על ידי הדירקטוריון האתי המוסדי של אוניברסיטת דיסלדורף. 1. הכנת Exosome <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את כל דם בצינורות 3 ציטראט באמצעות venipuncture (כולל של 9 מיליליטר). שופך את הדם לתוך צינור פלקון 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה המדגם ב 1500 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C ליזום הפרדה של תאי פלזמה. מעביר את supernatant לצינור בז 15 מיליליטר חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה המדגם ב2,800 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C כדי להסיר את כל התאים מפלזמה (פלזמה תא ללא; CFP). העבר את CFP לצינורות ultracentrifugation, 1 מ&quot;ל לכל צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב100,000 XG למשך 90 דקות ב 4 ° C כדי לרוקן exosomes. הסר 900 μl של supernatant. מחדש להשעות את גלולה בצינור ultracentrifugation 100 μl שנותר. להוסיף 900 ​​μl PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה שוב ב100,000 XG במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר 900 μl של supernatant. מחדש להשעות את גלולה עם 100 μl שנותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 5 עד 20 μl מחדש השעיה ב -40 מיליליטר מים מזוקקים. סנן את ההשעיה דרך מסנן 450 ננומטר להפריד exosomes מחלקיקים גדולים יותר. השתמש השעיה סופית למדידת חלקיקים. </li></ol> 2. הפעלת נוהל של החלקיקים המעקב Instrument <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התכנית על ידי לחיצה כפולה על התוכנה-הסמל. לחץ על כרטיסיות תוכנה השונות (&quot;צ&#39;ק תא&quot;, &quot;מדידה&quot;, &quot;ניתוח&quot;) כדי לעבור ביניהם בכל הפרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את ההוראות שעל המסך ליישום אוטומטי של הליך ההפעלה. בחר בתיבות עבור שניהם בדיקת איכות התא ויישור אוטומטי. הערה: או של השלבים הבאים ניתן לחזור בנפרד במידת צורך על ידי לחיצה על לחצן () או (ב) בכרטיסיית &quot;תא הבדיקה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח הכניסה ופתח יציאה של מכשיר נת&quot;ע ולהזריק 10 מ &#39;l מים מזוקק על ידי מזרק לתוך ערוץ התא דרך נמל הכניסה. סגור את פתח היציאה כסכום האחרון של מים שהוזרק. מניחים כוס תחת פתח היציאה לאיסוף פסולת פתרון. ודא שתא המדידה הוא ללא בועות אוויר ולא מזרק בועות אוויר לתוך המערכת. סגור את נמל הכניסה באופן מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את בדיקת איכות תא על ידי לחיצה על &quot;אישור&quot;. התוכנה תציג את התוצאות באיכות התא לאחר מספר שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם כל חלקיקים עדיין הם דמיינו במסך החי-המבט של התוכנה או אם התוצאה של בדיקת האיכות היא טובה או גרועה רק, חזרו על שלב 2.3 עד החלקיקים שנותרו יוסרו מתא המדידה. גם לחזור על שלב 2.3 לאחר כל מדידה, כדי למנוע הצטברות של חלקיקים. אם חוזר על הזרקת מים המזוקקת ותא בדיקה אינו מייצרת תוצאה &quot;טובה&quot;, המשך 2.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן השעיה שליטה המכילה pol בגודל nm 200 האחידחלקיקי ystyrene לשמש כדי ליישר את המוקדים של הלייזר ומיקרוסקופ. הוסף טיפה אחת של תרכיז ההשעיה, הניתנת על ידי יצרן המכשיר, 500 מיליליטר של מים מזוקקים כדי לקבל את הריכוז הנדרש כך ש600 ± 100 חלקיקים מוצגים כל מסך בשידור החי-הנוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את ההשעיה היישור למכשיר נת&quot;ע כמתואר בשלב 2.3. לחץ על &quot;אישור&quot; כדי להתחיל יישור אוטומטי, שיגרתי אוטומטי דרכו במערכת באופן אוטומטי למצוא את המיקום האופטימלי של שני מוקדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מופיעה הודעה לפיה המערכת מוכנה כעת לניסויים, לחץ על אישור כדי להתחיל את המדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדי פעם, לנקות את ערוץ התא באופן ידני בין ניסויים על ידי שטיפת התא עם פתרון 30% אתנול. נקה את הערוץ בכל פעם שהתוכנה מציגה דוח שגיאות אוטומטי. </li></ol> 3. מדידה של מדגם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הערוץ עם מים מזוקקים לפני eaמדידת ch מדגם (כמתואר בשלב 2.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את ההשעיה exosome (מוכנה בסעיף 1) לערוץ, כפי שמתואר בשלב 2.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את הפרמטרים העיקריים הבאים בתוכנה בהתאם לצורך: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רגישות. כדי למצוא את טווח הרגישות האופטימלי, לחץ על &quot;מספר החלקיקים לעומת רגישות&quot; כדי להציג עקומה לחלקיקים שנמדדו בכל מסך לרמות רגישות שונות. בחר רמת רגישות לפני השיפוע המרבי של העקומה. רמת רגישות גבוהה יותר מאפשרת הדמיה של חלקיקים יותר קטנים, אלא גם מגבירה את נושאים הקשורים לרעשי רקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהירות מינימאלית. בחר בהירות החל מ -20 למדידת exosome להשתמש בפונקציה זו כמסנן. להסדיר בפרמטר זה עד ריק החוצה בעוצמה חלקיקי פיזור האור. לווסת אותו כדי להגביר חלש פיזור חפצים. להשתנות בהירות בהתאם לצורך לאורך כל הניסוי. הערה: חלקיקים הקלים כלפיזור חזק מדי חפיפה וניתן לשלול מהניתוח בטעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גודל מינימום והמקסימום. להגדיר מסנן דיגיטלי לחסל רעש פיקסל ופיזור לא רצוי מחלקיקים גדולים מדי על ידי ויסות הגודל המינימאלי ומקסימאלי. השתמש במגוון של 10 עד 500 פיקסלים למדידת exosomes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תריס. התאם את משך זמן שהמצלמה פתוחה ל1 / 300 שניות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחיות פרמטרים לקרוא את: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר בין דיגיטלי ומודוס תצוגה אנלוגי בכל נקודה על ידי לחיצה על הכפתור &quot;Live-התמונה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאורך כל הניסוי, לפקח על הבר עצמת פיזור, המציג את מצב הרוויה של המדגם כמחוון צבע מקודד. לא לנתח exosomes אם שורת הפיזור היא אדומה. במקרה כזה לדלל עוד יותר את המדגם כדי להימנע מתופעה זו. אם תנאי הניסוי אוסר מניפולציה של ההשעיה המדגם, מטה-להסדיר את הרגישות או-להסדיר את הבהירות בתוכנה-settings כדי לשפר את תוצאות המדידה. הערה: כאשר דגימות עם ריכוז גבוה מאוד של חלקיקים מנותחות הפיזור יהיה הפתיל חלקיקים בודדים והם נספרים כחלקיק אחד בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב למספר החלקיקים נספרו בשדה ראייה מהתצוגה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הלשונית &quot;המדידה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר הגדרות במערך &quot;האפשרויות לרוץ&quot;. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני כל רכישה, בחר &quot;תנועת המחאה&quot; לבדיקה להיסחף חלקיקי בדיקה חוזרת ונשנית. בצע את הבדיקה לפחות פעם אחת לפני שמתחיל כל הניתוח. אם להיסחף גבוה מ -20 מיקרומטר / sec, לחכות לפני שתמשיך המדידה כך שהמדגם מפסיק לזרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את מספר הניסויים (5) והשהיית הזמן ביניהם (0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע &quot;בדיקה מדגמית&quot; במידת צורך. בדיקה זו היא חלק מהיישור האוטומטי בהליך להתחיל וניתן לחזור לאחר מכן במידת הצורך. </li&gt; </ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף לחץ על הכפתור &quot;רכישת וידאו לרוץ&quot;. בחלון החדש, להגדיר את מספר המחזורים (15) ומספר משרות מדידה (11). הערה: ראש הלייזר ומיקרוסקופ ניתן להעביר לנתח את מספר החלקיקים בשעה 11 בתנוחות שונות. בהתאם לדרישת ניסיוני, להחליט אם הניסוי צריכה להתבצע על עמדה אחת או בעמדות שונות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר את משך הזמן המינימלי חלקיקים יש להיות במעקב לייספר כחלקיק אחד בודד על ידי הגדרת הרזולוציה וידאו (הנמוך). תוצאות רזולוציה נמוכות יותר בזמן קצר יותר מעקב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר שם קובץ ולחץ על &quot;אישור&quot; כדי להתחיל מדידה. </li></ol></li></ol> 4. פרשנות של התוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצג את התוצאות הבאות ופרמטרים המוצגים לאחר מדידה בכרטיסיית &quot;תוצאות&quot;: (1) מספר כולל של חלקיקים לייחס, (2) מספר ממוצע של חלקicles למשרה, ו- (3) ריכוז חלקיקים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג את הטבלה ממוצעת התוצאה ליחס המספרי של גודל חלקיקים (קוטר, שטח ונפח) לשיעור של מספרי חלקיקים, כמו גם ערכים של ממוצע ובידול סטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בטבלת ניתוח שיא אם שיא אחד או יותר קיים בניתוח הגרפי. טבלה זו מציגה את ההתפלגות של חלקיקים שהם קטנים יותר מאשר השיא הראשון או שני בהתאמה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצג את הגרף מחושב לאחר המדידה כדי לראות הפצה של חלקיקים לפי גודל. השתמש בסמלים במצב התצוגה ומעל הגרף כדי לשנות את ההגדרות. </li></ol>

<ol>
	<li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., Bonifacino, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.+Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.+.">Chapter 3. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. .</a> Current protocols in cell biology / editorial board. (3.22), (2006).</li><li>Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+for+proteomic+analyses+and+RNA+profiling.">Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling.</a> Methods in molecular biology. 728, 235-246 (2011).</li><li>Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+RNA-containing+exosomes.">Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.</a> J. Vis. Exp. , e3037 (2012).</li><li>Konokhova, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-scattering+flow+cytometry+for+identification+and+characterization+of+blood+microparticles.">Light-scattering flow cytometry for identification and characterization of blood microparticles.</a> Journal of biomedical. 17, 057006 (2012).</li><li>Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+current+knowledge+of+their+composition,+biological+functions,+and+diagnostic+and+therapeutic+potentials.">Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials.</a> Biochimica et biophysica acta. 1820, 940-948 (2012).</li><li>Sokolova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+exosomes+derived+from+human+cells+by+nanoparticle+tracking+analysis+and+scanning+electron+microscopy.">Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy.</a> Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 87, 146-150 (2011).</li><li>Clayton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+antigen+presenting+cell+derived+exosomes,+based+on+immuno-magnetic+isolation+and+flow+cytometry.">Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry.</a> Journal of immunological. 247, 163-174 (2001).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> Amer. J. Phys. Renal Phys. 292, F1657-1661 (2007).</li><li>Carr, B., Warren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Company+profile:+NanoSight:+delivering+practical+solutions+for+biological+nanotechnology.">Company profile: NanoSight: delivering practical solutions for biological nanotechnology.</a> Nanomedicine. 7, 1129-1132 (2012).</li><li>Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal-like+vesicles+are+present+in+human+blood+plasma.">Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma.</a> International immunology. 17, 879-887 (2005).</li></ol>

This work was supported by the institutional funds of the Dept. of Cardiovascular Surgery, Medical Faculty, HHU. The publication costs of this study were provided by Particle MetrixGmbH.

אנחנו מדגימים פרוטוקול מפורט לבידוד exosome מהדם ומעקב ננו-חלקיקים נוכחי כחדשני ושיטה חדשנית למדידת גודל exosome וריכוז בנוזל ביולוגי. בניסויים שהוצגו דם היקפי אדם שימש כמקור exosomes. עם זאת, מקורות אחרים, כגון שתן, כיח, supernatant תרבית תאים, וכו &#39;, יכולים לשמש גם כחומר למבחן. בהתבסס על השונות הביולוגיות של ריכוז exosome בבני אדם, מבחני מאנשים שונים עשויים כוללים ריכוז להפליא משתנה של exosomes. עם זאת, הריכוז של חלקיקים בבדיקת המבחן הביולוגית עלול להיות השפעה על התוצאות. לכן, יש צורך בגישה אמינה וסטנדרטית לדילול של בדיקות. בשיטה המוצגת הפלזמה exosome מכיל נוצרה מ9 מיליליטר של כל דם היקפי. באמצעות צנטריפוגה ההפרש צעדים גלולה exosome הייתה מבודדת מ<html> פלזמה ו 1 מיליליטר מחדש תלויה 5 מיליליטר מים מזוקקים לתוצאה במדגם העבודה של exosomes המושעה. הגדרה מוגדרת מראש זה סיפקה לנו ריכוז נכון של חלקיקים, כלומר, עוצמת פיזור מתאימה במהלך נת&quot;ע. לצד היבט הנפח ודילול, ההרכב של הפתרונות המשמשים גם הוא בעל חשיבות. יש לנו להשתמש במים מזוקקים במשך מחדש ההשעיה הסופית של exosomes. כמובן, עשויה לשמש גם אמצעי תקשורת שונה לצעד הדילול הסופי, בהתאם לדרישות של ניסיוני ההגדרה. עם זאת, במקרה של מדידות zeta פוטנציאל של פתרונות-יוניים, במיוחד כאשר בודקים דגימות עם קיבולת חציצה, דילול זהיר בתנאים חופשיים מערבולת שימושי. לשם ההשוואה הישירה של דגימות מרובות אנו ממליצים לשמור על אותה רמת דילול עבור כל הדגימות. כל ההגדרות, מלבד הרגישות ורזולוצית וידאו ניתן לשנות לאחר מכן על ידי שימוש בתוכנת ZetaView ניתוח. &quot;Jove_content&quot;&gt; למרות שהחוקרים מאמינים כי המערכת הציגה במסמך זה כרגע מייצגת את המכשיר המתאים ביותר, זה לא מערכת נת&quot;ע זמינה רק. מספר הדיווחים הקודמים מועסק מערכות אחרות שחלות אותם עקרונות נת&quot;ע אבל מספקים עיצוב מכשיר אחר שהולך יחד עם כמה תכונות שונות 10. אנו מאמינים כי היבטים מעשיים הנוגעים לטיפול במדגם ושחזור של התוצאות הם בעלי חשיבות מרכזית בבחירת הרצף מתודולוגיים להערכת exosome. כמו כן, אנו מאמינים כי מערכת איתור אידיאלית צריכה לחסל גורמים-תלוי משתמש שעלול להפריע לתוצאות של המדידות. גישת ניתוח exosome שמוצג כאן מקיימת את המבחן של טיפול קל לרמה גבוהה. כיתרון נוסף, הניתוח אוטומטי למחצה של הדגימות מתבצע בתהליך מהיר, שהניבו תוצאות בזמן קצר. הדמיה מקוונת של exosomes מסייעת המנתח לgaברעיון מיידי של מאפייני exosome, למשל, ריכוז ברוטו. בנוסף מאוד פשוט אך אלגנטי לטכניקת המדידה שהוצגה כאן הוא השימוש בנוגדן שכותרתו exosomes והלכידה של קרן הלייזר מפוזרת באמצעות מסנן הקודם מול הגלאי. בדרך זו תת-אוכלוסיות exosome ניתן להבחין על פי אנטיגנים פני השטח ומאפיינים רלוונטיים מבחינה ביולוגית אחרים, כי הם מבחינה טכנית נגישות לצביעת ניאון סלקטיבית. אחד חסרונות של הגרסה הנוכחית של מכשיר מעקב חלקיקים שלנו הוא העובדה כי ברמות רגישות גבוהות מאוד חפצים כגון רעשי רקע יכולים להיות נוכחים, המבוסס על קיר ערוץ תא. פתרון טכני ושיפור למערכת הנוכחית עשויים להיות זמינים בעתיד הקרוב. על ידי השתקפויות שיטה זו של אור לייזר הפיזור על קיר הערוץ יקטן, ובכך להגדיל<html> הדיוק של האותות הנמדדים ונתונים המתקבלים והוריד את המגבלה של זיהוי. אף על פי הפרוטוקול המשמש כיום לבידוד exosome מבוסס היטב ויש לו מכשיר מעקב חלקיקים מיושם רזולוציה מדויקת להפליא עם התפלגות גודל נמוכה יותר של 30 ננומטר, אין ערובה לכך שהחלקיקים זוהו אכן exosomes לגמרי נכון. חלקיקים אחרים, כגון שברי תאים מתים או קומפלקסי חלבונים גדולים יותר עשויים גם להיות נוכחים בהשעית exosome ולהוביל לאותות חיוביים כוזבים. שיטה אמינה אחד שבו &quot;זיהום&quot; כזה יכול להיות שלילי עשוי להיות במיקרוסקופ אלקטרונים (EM), או EM שידור או EM סריקה. למרבה הצער, אין סמן כללי וספציפי לexosomes זוהה עד כה, אם כי מספר סמני משטח הציעו בעבר זכה כמות הולך וגדלה של תשומת לב, כוללים tetraspanin (Tspan), CD81, C63, CD9, וכו &#39;11. &quot;&gt; ללא קשר להתקדמות בעתיד של מחקר על הביולוגיה exosome, בעיקר בכל הנוגע סמנים ספציפיים exosome, הפרוטוקול המוצג כאן יספק שיטה רבת עוצמה לבידוד וזיהוי של exosomes. ריכוז וגודל יכולים להיקבע בקלות בסיוע תוכנה אופנה פשוטה. התוספת של סמני ניאון סלקטיבית או נוגדני fluorophore בשילוב צפוי לשפר עוד יותר את היישומים האפשריים של הגישה שהוצגה של נת&quot;ע.

הפונקציה של exosomes במחזור המדויקת נשארה לא ידועה לתקופה ארוכה של זמן. אפילו עכשיו מנגנון נתיב המלא של exosomes לא מובן לחלוטין. מאז exosomes לשאת אנטיגנים, חלבונים ו- RNA (mRNA ומירנה) המתייחס לתא שלהם ההורים ממוצא, תפקידם כמשדרי איתות תאי תאים יש בעיקר ניתנו עדיפות. שיטות שונות רבות תוארו בספרות לבידוד וזיהוי כמותי של exosomes 1,2. עם זאת, לא הושגה הסכמה על &quot;תקן זהב&quot;. בינתיים רוב המדענים הפועלים בתחום מחקר exosome מסכימים ששיטה של ​​בידוד עקבי היא מוצדקת מאוד כדי להשיג רמה גבוהה יותר של השוואתיים בין דוחות ומחקרים שונים. מיון הקרינה מופעל תאים (FACS) הוא הכלי הנפוץ והשכיח ביותר לניתוח exosome 3. FACS יש בןefit ש, באמצעות תיוג הקרינה, ניתן להשוות תאים ממקורות שונים בצעד אחד. החסרונות העיקריים של FACS הם ששיטה זו אינה רגישה מספיק כדי לזהות חלקיקים קטנים מ -0.5 מיקרומטר 4, ואילו exosomes הן בדרך כלל בין 30-120 ננומטר בקוטר 5, אפילו פחות כדי למדוד את הגודל שלהם. במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) ומיקרוסקופי אלקטרונים הילוכים (TEM) הם כלים אחרים לניתוח גודל חלקיקים ומורפולוגיה של exosomes. עם זאת, שני SEM וTEM החסרון כי הכנת הדגימות היא, בשתי השיטות כרוכות בצעדים עתיר עבודת זמן רב וכל אחד יש סיכון מסוים של דור חפץ. לא השיטה מתאימה לתפוקת מדגם גבוהה ואפיון של כמה אלפי חלקיקים בודדים של מדגם אחד. יתר על כן, ניתוח כמותי לשגרה יומית קלינית שבו דגימות יש לעתים קרובות כדי להיות מנותח בו זמנית, או לפחות בפרק זמן קצר מאוד הואקשה לביצוע. טכניקות דור חדשות עכשיו מאפשרות לנו לנתח exosomes ללא עבודה אינטנסיבית לפני ההכנה (SEM למשל, איכות הסביבה). הטכניקות המודרניות אלה הן עדיין לא נוחים לניתוח השעיות נפח גדולים המכילות exosomes לקבוע מספר הממוצע שלהם והתפלגות גודל 6. שיטה נוספת רגישה מאוד להדמיה וניתוח של exosomes היא ניתוח מעקב ננו-חלקיקים (נת&quot;ע). שיטה זו מנצלת את שני עקרונות שונים של פיסיקה. ראשית, חלקיקים מזוהים על ידי האור מפוזר כאשר הם מוקרנים עם קרן לייזר. התופעה השנייה ידועה בשם התנועה בראונית, לפיה דיפוזיה של חלקיקים שונים בהשעית נוזל עומד ביחס הפוך לגודלם. במקרה האחרון התנועה תלויה גם בטמפרטורה והצמיגות של הנוזלים. עם זאת, שיעור זה קשור באופן ישיר לגודל חלקיקים ומשמש את נת&quot;ע. באמצעות רךניתוח מבוסס-ware, תמונות דיגיטליות של אור מפוזר מחלקיקים בודדים נרשמות. חלקות של כתמים מפוזרים אור ומהירות תנועה שלהם לספק נתונים המאפשרים קביעת ספירת חלקיקים כוללת והפצת גודל. טכניקה זו היא חזקה במיוחד לניתוח חלקיקים בקוטר ממוצע של פחות מ -100 ננומטר. מדידות הגודל וריכוז מבוצעות עם ראונית ZetaView ואלקטרופורזה Motion Video ניתוח מיקרוסקופים. זהו מכשיר אוטומטי למחצה שולחן ננו-חלקיקים העליונים ניתוח לדגימות נוזליים (להלן ככלי מעקב אחר החלקיקים). זה מורכב של מנתח מעקב החלקיקים, כמו גם מחשב נייד עם התוכנה המשמשת לניתוח נתונים. דגימות ביולוגיות הטרוגנית הן כמתאימות לשיטה זו כמתלים הומוגנית יותר של חלקיקים אורגניים. מיקרוסקופ פיזור לייזר עם מצלמת וידאו משמש לזיהוי של חלקיקים ולobservation של תנועתם. בעוד ציר מיקרוסקופ הוא אופקי וממוקד לערוץ התא המלא בהשעיה מכילה exosomes, קרן הלייזר בכיוון אנכית. החלקיקים מוקרנים על ידי פיזור לייזר האור, אשר נרשם תחת 90 מעלות במצלמת וידאו דיגיטלית באמצעות מיקרוסקופ (איור 1). עוצמת האור המפוזר מאפשרת תצפית של חלקיקים גדולים יותר בקוטר 60 ננומטר. בסביבה כזו הבהירות של חלקיק היא לא האינדיקציה היחידה של גודל חלקיקים. כאשר אין שדה חשמלי מוחל, תנועת חלקיקים כדלקמן רק תנועה בראונית ועשויה לשמש כמדד לחישוב גודל חלקיקים. עם זאת, המכשיר הוא גם מסוגל החלת שדה חשמלי על פני ערוץ התא. כאשר נתון תחום זה, את הפוטנציאל, הקוטביות ורמת יונית-אחראי exosomes המושעה להיות גורמים נוספים לכיוון התנועה שלהם. מהירות וכיוון בתוצאת מו electrophoreticהיסטוגרמה bility. תוך מציאת שיטה אופטימלית לניתוח exosomes המבודד בעיה אחת, עוד אחד נמצא בבידוד היעיל של exosomes מהתחומים שונים, כגון דם, מיימת, שתן, חלב, מי שפיר או תקשורת סלולארי. שיטות שונות תוארו עד כה, אשר מבוססות על ultracentrifugation 1, ריאגנטים תעשייתיים הפרדה (כגון Exoquick) 7, חרוזים מגנטיים לאנטיגן העסקת הפרדה 8 או 9 אולטרה שלבים. בפרוטוקול זה אנו מראים את כל התהליך של בידוד exosome באמצעות ultracentrifugation ולהראות כיצד לנתח את exosome כתוצאה מכיל השעיה באמצעות מכשיר מעקב אחר חלקיקים. שיקולים ספציפיים לניתוח exosomes נגזר בינוני פלזמה או תרבית תאים האנושיות מסופקים.

<table><tbody><tr><td>Citrate tube</td><td>BD</td><td>364305</td><td>BD Vacutainer</td></tr><tr><td>Distilled water</td><td>Braun</td><td>3880087</td><td>Aqua ad iniectabilia</td></tr><tr><td>Falcon tube</td><td>Greiner Bio One</td><td>188271</td><td>PP Tube, Steril 15 ml</td></tr><tr><td>Ultracentrifugation tube</td><td>Beckman</td><td>357448</td><td>Microfuge Tube Polyallomer 1.5 ml</td></tr><tr><td>Polybead</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>07304</td><td>2.6% Solids-Latex&lt;br/&gt; Alignment Solution</td></tr><tr><td>Syringe (Filter)</td><td>Braun</td><td>4617053V</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Syringe (ZetaView)</td><td>Braun</td><td>4606051V</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Needle</td><td>BD</td><td>305180</td><td>BD Blunt Fill Needle</td></tr><tr><td>Filter</td><td>Sartorius Stedim</td><td>16555</td><td>Syringe filter, hydrophilic, 450 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman</td><td>L8-M</td><td>Rotor: 70Ti Ser. No E21078</td></tr><tr><td>ZetaView</td><td>Particle Metrix</td><td>PMX 100, Type 101</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>Rotor: A-4-44</td></tr></tbody></table>

an innovative method for exosome quantification and size measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

המדגם המשמש להפגנה זה מראה הגדרה אופטימלית למדידה עם רגישות של 85%, לפני השיפוע המרבי של עקומת הרגישות (איור 2). הבהירות, דקות / ערכי מקסימום נבחרו כמומלץ בפרוטוקול. ריכוז של 5.3 חלקיקים / ml x 10 6 נמדדו, ואילו הגודל הממוצע של החלקיקים היה 0.149 מיקרומטר, רובם היו 0.137 מיקרומטר. הערכים שהתקבלו לאחר המדידה ניתן לשמור בדו&quot;ח עם פורמט קובץ של Pdf או כ.txt ליצוא למסד נתונים. הגרף יכול להיות מותאם כמועדף כפי שתואר בפרוטוקול (סעיף 4). רצף הווידאו נשמר גם וניתן להשתמש בם לשימוש מאוחר יותר מחדש ניתוח off-line. עם זאת, בניתוח off-line כגון, ההגדרות מראש רכישת המצלמה לא ניתן לשנות למפרע. כדי למצוא את ההגדרות אופטימליות עבור פרמטר מדידה, אנחנו כאן לתאר האופטימיזציה דואר של הגדרות מכשיר על הדוגמא של תקן גודל קלקר 100 ננומטר. ההשפעה של שני פרמטרים, רגישות ודקות / גודל מקסימלי על הפצת תמונת וידאו וגודל חלקיקים נדונה בפירוט. כל הפרמטרים האחרים מסוכמים בטבלה 1. רושם חזותי של ההשפעה של רגישות (הנעה 50-94) על תמונות אנלוגיות ודיגיטליות הוא מדמיין באיור 3. המידע כמותי נגזר מהתמונות מוצג באיור 4, המבוסס על ההגדרות בטבלה 1, גודל Min = 5 וגודל מקס = 200. מערכת יחסים אופייניים למספר החלקיקים שאותרו מול הרגישות מוצג באיור 4 א. בין 50 ל -90, מספר החלקיקים זוהו עלייה ברגישות ובעלה באופן דרמטי לרגישויות&gt; 90. טווח אופטימלי של רגישות נמצא בין 66 ו -86 (א). הפצות גודל חלקיקים שהושגו עם DIFהגדרות רגישות שונה זו מוצגות באיור 4. הפצות גודל חלקיקים מייצגות את הממוצע של שלוש מדידות בודדות. לנמוכה מדי רגישות (רגישות = 62, עקומה אדומה) רק כמה חלקיקים נותחו וכתוצאה מכך בסטטיסטיקה די גרועה. מספר החלקיקים ניתחו גדל ברגישות ובהגיע אופטימלי בין 70 (עקומה צהובה) ו -86 (עקומת שיזוף). בהמשך הגדיל את יתרון הרגישות להידרדרות של התפלגות גודל חלקיקים עם מספר החלקיקים יורדים והתפלגות גודל הסטה לכיוון גדלים קטנים יותר (רגישות = 94, עקומה כחולה). איור 4C מראה את המגמה של קוטר x50 מבוסס המספר (50% מ חלקיקים קטנים יותר בקוטר זה) כפונקציה של רגישות. במרווח בצבע בז &#39;, RSD של גודל חלקיקים היה פחות מ -8% ותואם את המרווח האופטימלי בא האזורים האדומים מצביעים RSD&gt; 8% כתוצאה מנתונים סטטיסטיים עלובים (רגישות נמוכה מדי) או distri הרחבbutions עם מעבר לגדלים קטנים יותר (רגישות גבוהה מדי). ההגדרות של גודל מינימאלי וגודל המקסימלי הן מסננים להחיל תמונות דיגיטליות על מנת להסיר חלקיקים בגדלים קטנים יותר מגודל נקודת מינימום וגדולים יותר מגודל מקסימלי. בשל היכולת לפזר אור, חלקיקים יוצרים נקודה בגודל מסוים בתמונה דיגיטלית. גודלו של המקום נמדד כמספר הפיקסלים (פיקסלים). כאשר חלקיק מפזר אור טוב מאוד (למשל, חלקיקים&gt; 200 ננומטר או אגרגטים), גודל הנקודה הוא די גדול, למשל,&gt; px 500. גודל הנקודה הוא די קטן (למשל, &lt;10 px) לחלקיקים קטנים (למשל, &lt;20 ננומטר) בתלות בחומר החלקיקים. גודל נקודה (פיקסלים) עשוי שלא להיות להחלפה עם גודל חלקיקים (ננומטר) כפי שהם אינם זהים, ואין קשר ישיר בין שני המשתנים הללו. אופטימיזציה של גודל מינימום ומקס מאפשרת למשתמש לסנן אובייקטים לא רצויים כגון agglomerates (גודל מקסימלי) או קטןאובייקטים כגון רעשי רקע (גודל מינ &#39;). ההשפעה של גודל מינימום / מקסימום בגודל חלקיקי ההפצה של סטנדרטי בגודל 100 ננומטר מוצגת באיור 4D (רגישות = 82). כאשר המרווח מוגדר גדלי נקודה קטנים (למשל, דקות = 1, מקסימום = 52; עקומה כתומה), מספר החלקיקים ניתחו מצטמצם וקוטר x50 מבוסס המספר מעט השתנה לכיוון גדלים קטנים יותר. הגדרה לכתמים גדולים יותר (מינימום = 40, מקסימום = 1000, עקומה אדומה) תוצאות בהתפלגות גודל חלקיקים רחבות הוסטה לעבר גדלים גדולים יותר. על מנת לקבל את המספרים מוחלט שווים של חלקיקים, גבולות המרווח של הפצות שני כתומות ואדומות הותאמו כדי להתאים 80 חלקיקים. ההפצה עם הגדרות אופטימליות (דקות = 5, מקסימום = 200; עקומת שיזוף) מורכבת מחלקיקים 360. סדרת ניסויים מוצלחים בוצעה עם exosomes מבודד על ידי ultracentrifugation ונמדד על ידי נת&quot;ע שימוש במערכת שהוצגה. נתונים שהתקבלו היו מאודעולה בקנה אחד ואישרתי ברמה גבוהה של שחזור. שיטות בידוד אחרות צריכים להראות תוצאות דומות. עם זאת, צעד הדילול זוהה כצעד קריטי במיוחד והשפעתה על המספרים הכולל המחושבים של חלקיקים יש הערכה מחדש. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig1.jpg" /> איור 1. סכמטי של ההתקנה של נת&quot;ע. מיקרוסקופ / ציר הווידאו וקרן לייזר מכוון orthogonally זה לזה, שחצו בחתך ערוץ תא. האור מפוזר על ידי החלקיקים מוצג בחלון &quot;חי-הנוף&quot; של התוכנה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig2.jpg" /> <strong&gt; מספר איור 2. חלקיקים לעומת עקומת רגישות. מספר החלקיקים לעומת עקומת רגישות מציג את החלקיקים בעמדה אחת ברגע אחד במהלך סריקת רגישות אוטומטית. הדמיה גרפית זה משמשת כדי לקבוע את ההעדפות הטובות ביותר עבור המדידות הראשוניות. ערך רגישות נבחר לפני השיפוע המרבי של הגרף. חשוב לזכור כי ממצאים אינם בוטלו בניסוי בדיקה זו ויכולים להשפיע על הגרף. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig3.jpg" /> איור 3. השפעה של רגישות על אנלוגי ותמונה דיגיטלית. יזואליזציה של חלקיקים על מסך התצוגה החיה מוצגת לרגישויות בין 50 ל 94 לאנלוגית (שורה העליונה)צפיות ד דיגיטליות (בשורה התחתונה). כאשר הרגישות נמוכה מדי, רק כמה חלקיקים מזוהים (משמאל). ברגישות אופטימלית החלקיקים מופיעים נקודות בודדות כמבודדות היטב אחד מהשני (באמצע). בחלקיקי רגישות גבוהים יחסית יחד למזג מובילים לאיכות תמונה ירודה (מימין). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig4.jpg" /> השפעה של איור 4. דקות רגישות והגדרות גודל מרביות למדגם חלקיקי פוליסטירן 100 ננומטר שליטה (א) מגרש של רגישות לעומת מספר מזוהה של חלקיקים.; המרווח האופטימלי הוא 66-86, לפני השיפוע המרבי של העקומה. הפצות גודל (B) חלקיקים שהושגו עם כמה הגדרות רגישות (62-94); גרפים לנמוכים מדי (62) או גבוה מדי (94) רגישות אינה ממצה את התפלגות גודל חלקיקים במדגם שליטת קלקר 100 ננומטר. קוטר x50 מספר מבוסס לעומת רגישות (ג); השגיאה של x50 במרווח בצבע בז &#39;היא פחות מ 8%, מרווח אופטימלי הוא מ -66 ל86. (ד) השפעה של גודל מינימאלי והמקסימאלי על התפלגות גודל חלקיקים; פרמטרים אופטימליים (דקות = 5 ומקסימום = 200) ללכוד את החלוקה הנכונה למדגם השליטה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> פרמטרים טרום רכישה </td></tr><tr><td> רגישות </td><td> משתנה </td></tr><tr><td> תריס </td><td> 40 </td></tr><tr><td> קצב פריימים </td><td> 30 fps </td></tr><tr><td> רזולוציה </td><td> הייGH </td></tr><tr><td> מחזורים </td><td> 10 </td></tr><tr><td> רכישות מרובות </td><td> 3 </td></tr><tr><td> עמדה </td><td> 1 </td></tr><tr><td colspan="2"> פרמטרים שלאחר רכישה </td></tr><tr><td> דקות בהירות </td><td> 30 </td></tr><tr><td> גודל מקסימלי </td><td> משתנה </td></tr><tr><td> גודל דקות </td><td> משתנה </td></tr></tbody></table> סיכום 1. טבלה של פרמטרים של לפני ואחרי רכישה להגדרה של מכשיר מעקב אחר חלקיקים.

Watch this Scientific Journal Video about An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement at JoVE.com

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

שיטה חדשנית לExosome כימות ומדידה גודל

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

an-innovative-method-for-exosome-quantification-and-size-measurement

Research

JoVE Journal

Biology

30.7K Views.  Heinrich-Heine-University Dusseldorf. A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Video: An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and RNAs, are unique to the cells from which they are derived and can be used as indicators of disease. Several common enrichment protocols, including ultracentrifugation, yield exosomes laden with soluble protein contaminants. Specifically, we have found that the most abundant proteins within blood often co-purify with exosomes and can confound downstream proteomic studies, thwarting the identification of low abundance biomarker candidates. Of additional concern is irreproducibility of exosome protein quantification due to inconsistent representation of non-exosomal protein levels. The protocol detailed here was developed to remove non-exosomal proteins that co-purify along with exosomes, adding rigor to the exosome purification process. Five methods were compared using paired blood plasma and serum from five donors. Analysis using nanoparticle tracking analysis and micro bicinchoninic acid protein assay revealed that a combined protocol utilizing ultrafiltration and size exclusion chromatography yielded the optimal vesicle enrichment and soluble protein removal. Western blotting was used to verify that the expected abundant blood proteins, including albumin and apolipoproteins, were depleted.

Here, we present a protocol to purify exosomes from both plasma and serum with reduced co-purification of non-exosomal blood proteins. The optimized protocol includes ultrafiltration, protease treatment, and size exclusion chromatography. Enhanced purification of exosomes benefits downstream analyses, including more accurate quantification of vesicles and proteomic characterization.

עיכול חלבון אולטראפילטרציה, גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה כדי למטב את ניתוקה של Exosomes פלזמה דם אנושי, סרום

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Biochemistry

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, and intrinsic capability in intercellular delivery of various biomolecules. This work establishes an isolation protocol to achieve high yield and high purity of exosomes for siRNA delivery. Human Embryonic Kidney cells (HEK-293 cells) are cultured in bioreactor flasks and the culture supernatant (hereon referred to as conditioned medium) is harvested on a weekly basis to allow for enrichment of HEK-293 exosomes. The conditioned medium (CM) is pre-cleared of dead cells and cellular debris by differential centrifugation and is subjected to ultracentrifugation onto a sucrose cushion followed by a washing step, to collect the exosomes. Isolated HEK-293 exosomes are characterized for yield, morphology and exosomal marker expression by nanoparticle tracking analysis, protein quantification, electron microscopy and flow cytometry, respectively. Small interfering RNA (siRNA), fluorescently labeled with Atto655, is loaded into exosomes by electroporation and excess siRNA is removed by gel filtration. Cell uptake in PANC-1 cancer cells, after 24 h incubation at 37 &#176;C, is confirmed by flow cytometry. HEK-293 exosomes are 107.0 &#177; 8.2 nm in diameter. The exosome yield and particle-to-protein ratio (P:P) ratio are 6.99 &#177; 0.22 &#215; 1012 particle/mL and 8.3 &#177; 1.7 &#215; 1010 particle/&#181;g, respectively. The encapsulation efficiency of siRNA in exosomes is ~ 10-20%. Forty percent of the cells show positive signals for Atto655 at 24 h post-incubation. In conclusion, exosome isolation by ultracentrifugation onto sucrose cushion offers a combination of good yield and purity. siRNA could be successfully loaded into exosomes by electroporation and subsequently delivered into cancer cells in vitro. This protocol offers a standard procedure for developing siRNA-loaded exosomes for efficient delivery to cancer cells.

An exosome is a new generation of drug delivery carriers. We established an exosome isolation protocol with high yield and purity for siRNA delivery. We also encapsulated fluorescently labelled non-specific siRNA into exosomes and investigated the cellular uptake of siRNA-loaded exosomes in cancer cells.

הכנה של Exosomes siRNA מסירה תאים סרטניים

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Cancer Research

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have witnessed a tremendous increase in interest in EVs. EVs have been shown to play important roles in various physiological and pathological processes, including coagulation, immune responses, and cancer. In addition, EVs have potential as therapeutic agents, for instance as drug delivery vehicles or as regenerative medicine. Because of their small size (50 to 1,000 nm) accurate quantification and size profiling of EVs is technically challenging.
This protocol describes how tunable resistive pulse sensing (tRPS) technology, using the qNano system, can be used to determine the concentration and size of EVs. The method, which relies on the detection of EVs upon their transfer through a nano sized pore, is relatively fast, suffices the use of small sample volumes and does not require the purification and concentration of EVs. Next to the regular operation protocol an alternative approach is described using samples spiked with polystyrene beads of known size and concentration. This real-time calibration technique can be used to overcome technical hurdles encountered when measuring EVs directly in biological fluids.

Extracellular vesicles play important roles in physiological and pathological processes, including coagulation, immune responses, and cancer or as potential therapeutic agents in drug delivery or regenerative medicine. This protocol presents methods for the quantification and size characterization of isolated and non-isolated extracellular vesicles in various fluids using tunable resistive pulse sensing.

כימות וגודל-פרופיל של תאית שלפוחית ​​באמצעות Pulse חישה מתכוונן התנגדותי

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

Bioengineering

A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.

This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.

שיטת ממטרים השתנה לבודד השתן Exosomes

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. ...

Medicine

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective tyrosine kinase inhibitors (TKIs). To optimize the use of these TKIs, the discovery of new biomarkers for early detection and disease progression is mandatory. These plasma-isolated exosomes can be used as a non-invasive and repeatable way for the detection and follow-up of these biomarkers. One ml of plasma from 12 NSCLC patients, with different mutations and treatments (and 6 healthy donors as controls), were used as exosome sources. After RNAse treatment, in order to degrade circulating miRNAs, the exosomes were isolated with a commercial kit and resuspended in specific buffers for further analysis. The exosomes were characterized by western blotting for ALIX and TSG101 and by transmission electron microscopy (TEM) analysis, the standard techniques to obtain biochemical and dimensional data of these nanovesicles. Total RNA extraction was performed with a high yield commercial kit. Due to the limited miRNA-content in exosomes, we decided to perform retro-transcription PCR using an individual assay for each selected miRNA. A panel of miRNAs (30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222), all correlated with NSCLC disease, were analyzed taking advantage of the remarkable sensitivity and specificity of Real-Time PCR analysis; mir-1228-3p was used as endogenous control and data were processed according to the formula 2-&#916;&#916;ct 13. Control values were used as baseline and results are shown in logarithmic scale.

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer NSCLC Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

This protocol describes the feasibility to perform miRNA profiling in exosomes, released in plasma of NSCLC patients, through a commercial exosome isolation kit with Proteinase K and RNAse treatments, in order to avoid circulating miRNAs contamination and evaluate their biomarker features in NSCLC.

ניתוח מירנה Exosomal ב non-small cell סרטן ריאות (NSCLC) מטופלים פלזמה באמצעות qPCR: כלי ביופסיה נוזלי ריאלי

The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective ...

Using Nanoplasmon-Enhanced Scattering and Low-Magnification Microscope Imaging to Quantify Tumor-Derived Exosomes

Infected or malignant cells frequently secrete more exosomes, leading to elevated levels of disease-associated exosomes in the circulation. These exosomes have the potential to serve as biomarkers for disease diagnosis and to monitor disease progression and treatment response. However, most exosome analysis procedures require exosome isolation and purification steps, which are usually time-consuming and labor-intensive, and thus of limited utility in clinical settings. This report describes a rapid procedure to analyze specific biomarkers on the outer membrane of exosomes without requiring separate isolation and purification steps. In this method, exosomes are captured on the surface of a slide by exosome-specific antibodies and then hybridized with nanoparticle-conjugated antibody probes specific to a disease. After hybridization, the abundance of the target exosome population is determined by analyzing low-magnification dark-field microscope (LMDFM) images of the bound nanoparticles. This approach can be easily adopted for research and clinical use to analyze membrane-associated exosome biomarkers linked to disease.

Clinical translation of exosome-derived biomarkers for diseased and malignant cells is hindered by the lack of rapid and accurate quantification methods. This report describes the use of low-magnification dark-field microscope images to quantify specific exosome subtypes in small volume serum or plasma samples.

שימוש Nanoplasmon-משופרת פיזור מיקרוסקופ נמוך הגדלה הדמיה כדי לכמת הגידול הנגזר בגידולים

Infected or malignant cells frequently secrete more exosomes, leading to elevated levels of disease-associated exosomes in the circulation. These exosomes ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

בידוד Profiling של MicroRNA המכיל Exosomes מן האדם מר

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

בידוד ואפיון של RNA המכיל Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving area of research. There are many different methods for EV isolation, each with distinct advantages and disadvantages that affect the downstream yield and purity of EVs. Thus, characterizing the EV prep isolated from a given source by a chosen method is important for interpretation of downstream results and comparison of results across laboratories. Various methods exist for determining the size and quantity of EVs, which can be altered by disease states or in response to external conditions. Nanoparticle tracking analysis (NTA) is one of the prominent technologies used for high-throughput analysis of individual EVs. Here, we present a detailed protocol for quantification and size determination of EVs isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma using a breakthrough technology for NTA representing major advances in the field. The results demonstrate that this method can deliver reproducible and valid total particle concentration and size distribution data for EVs isolated from different sources using different methods, as confirmed by transmission electron microscopy. The adaptation of this instrument for NTA will address the need for standardization in NTA methods to increase rigor and reproducibility in EV research.

We demonstrate how to use a novel nanoparticle tracking analysis instrument to estimate the size distribution and total particle concentration of extracellular vesicles isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma.

ניתוח מעקב חלקיקים לכימות וקביעת גודל של שלל חוץ-תאי

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

<meta charset="utf8"></head><body>טכניקות זיקוק לבידוד אקסוזום המופק מטחול מורין

Isolation and Characterization of Exosomes Derived from Mouse Spleen Tissues

Exosomes (Exo) are lipid-bilayer structures secreted by various cells, including those of animals, plants, and prokaryotes. Previous studies have revealed that Exo derived from humoral or cell-supernatant are promising targets for novel diagnostic or prognostic biomarkers, underscoring their significant role in disease pathogenesis. Tissue-derived Exo (Ti-Exo) have attracted increasing attention due to its ability to accurately reflect tissue specificity and the microenvironment. Ti-Exo, present in interstitial space, play crucial roles in intercellular communication and cross-organ signaling. Despite their recognized value in elucidating disease mechanisms, isolating Ti-Exo remains challenging due to the complexity of tissue matrices and variability in extraction methods. In this study, we developed a practical protocol for isolating exosomes from mice spleen tissue, providing a reproducible technique for subsequent identification analysis and functional studies. We used Type I collagenase digestion combined with differential ultracentrifugation to isolate spleen-derived Exo. The characteristics of isolated Exo were determined through electron microscopy, the nano-flow cytometer, and the western blot. The isolated spleen-derived Exo displayed the typical morphology of lipid bilayer vesicles, with particle sizes ranging from 30 nm to 150 nm. In addition, the expression profile of exosome markers confirmed the presence and purity of exosomes. Taken together, we successfully established a practical protocol for isolating spleen-derived Exo in mice.

<meta charset="utf8"></head><body>בידוד ואפיון אקסוזומים שמקורם ברקמת הטחול של העכבר

Here, we present a protocol to isolate mouse spleen-derived exosomes using a combination of digestion with collagenase type I and ultracentrifugation.

בידוד ואפיון אקסוזומים שמקורם ברקמת הטחול של העכבר

Exosomes (Exo) are lipid-bilayer structures secreted by various cells, including those of animals, plants, and prokaryotes. Previous studies have revealed ...

שיטה חדשנית לExosome כימות ומדידה גודל

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

עיכול חלבון אולטראפילטרציה, גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה כדי למטב את ניתוקה של Exosomes פלזמה דם אנושי, סרום

הכנה של Exosomes siRNA מסירה תאים סרטניים

כימות וגודל-פרופיל של תאית שלפוחית באמצעות Pulse חישה מתכוונן התנגדותי

שיטת ממטרים השתנה לבודד השתן Exosomes

ניתוח מירנה Exosomal ב non-small cell סרטן ריאות (NSCLC) מטופלים פלזמה באמצעות qPCR: כלי ביופסיה נוזלי ריאלי

שימוש Nanoplasmon-משופרת פיזור מיקרוסקופ נמוך הגדלה הדמיה כדי לכמת הגידול הנגזר בגידולים

בידוד Profiling של MicroRNA המכיל Exosomes מן האדם מר

בידוד ואפיון של RNA המכיל Exosomes

ניתוח מעקב חלקיקים לכימות וקביעת גודל של שלל חוץ-תאי

בידוד ואפיון אקסוזומים שמקורם ברקמת הטחול של העכבר

שיטה חדשנית לExosome כימות ומדידה גודל

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

עיכול חלבון אולטראפילטרציה, גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה כדי למטב את ניתוקה של Exosomes פלזמה דם אנושי, סרום

הכנה של Exosomes siRNA מסירה תאים סרטניים

כימות וגודל-פרופיל של תאית שלפוחית ​​באמצעות Pulse חישה מתכוונן התנגדותי

שיטת ממטרים השתנה לבודד השתן Exosomes

ניתוח מירנה Exosomal ב non-small cell סרטן ריאות (NSCLC) מטופלים פלזמה באמצעות qPCR: כלי ביופסיה נוזלי ריאלי

שימוש Nanoplasmon-משופרת פיזור מיקרוסקופ נמוך הגדלה הדמיה כדי לכמת הגידול הנגזר בגידולים

בידוד Profiling של MicroRNA המכיל Exosomes מן האדם מר

בידוד ואפיון של RNA המכיל Exosomes

ניתוח מעקב חלקיקים לכימות וקביעת גודל של שלל חוץ-תאי

בידוד ואפיון אקסוזומים שמקורם ברקמת הטחול של העכבר

כימות וגודל-פרופיל של תאית שלפוחית באמצעות Pulse חישה מתכוונן התנגדותי