The authors would like to thank Christina Ball&#225;zs, Hug Aubin and J&#246;rn H&#252;lsmann for the critical reading of the manuscript and excellent editorial assistance. Moreover, the authors thank Gisela Mueller for the technical assistance. The authors thank Particle Metrix GmbH for providing the funds covering the publication costs.

הערה: הניסויים שהוצגו בעבודה זו אושרו על ידי הדירקטוריון האתי המוסדי של אוניברסיטת דיסלדורף. 1. הכנת Exosome <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את כל דם בצינורות 3 ציטראט באמצעות venipuncture (כולל של 9 מיליליטר). שופך את הדם לתוך צינור פלקון 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה המדגם ב 1500 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C ליזום הפרדה של תאי פלזמה. מעביר את supernatant לצינור בז 15 מיליליטר חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה המדגם ב2,800 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C כדי להסיר את כל התאים מפלזמה (פלזמה תא ללא; CFP). העבר את CFP לצינורות ultracentrifugation, 1 מ&quot;ל לכל צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב100,000 XG למשך 90 דקות ב 4 ° C כדי לרוקן exosomes. הסר 900 μl של supernatant. מחדש להשעות את גלולה בצינור ultracentrifugation 100 μl שנותר. להוסיף 900 ​​μl PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה שוב ב100,000 XG במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר 900 μl של supernatant. מחדש להשעות את גלולה עם 100 μl שנותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 5 עד 20 μl מחדש השעיה ב -40 מיליליטר מים מזוקקים. סנן את ההשעיה דרך מסנן 450 ננומטר להפריד exosomes מחלקיקים גדולים יותר. השתמש השעיה סופית למדידת חלקיקים. </li></ol> 2. הפעלת נוהל של החלקיקים המעקב Instrument <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התכנית על ידי לחיצה כפולה על התוכנה-הסמל. לחץ על כרטיסיות תוכנה השונות (&quot;צ&#39;ק תא&quot;, &quot;מדידה&quot;, &quot;ניתוח&quot;) כדי לעבור ביניהם בכל הפרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את ההוראות שעל המסך ליישום אוטומטי של הליך ההפעלה. בחר בתיבות עבור שניהם בדיקת איכות התא ויישור אוטומטי. הערה: או של השלבים הבאים ניתן לחזור בנפרד במידת צורך על ידי לחיצה על לחצן () או (ב) בכרטיסיית &quot;תא הבדיקה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח הכניסה ופתח יציאה של מכשיר נת&quot;ע ולהזריק 10 מ &#39;l מים מזוקק על ידי מזרק לתוך ערוץ התא דרך נמל הכניסה. סגור את פתח היציאה כסכום האחרון של מים שהוזרק. מניחים כוס תחת פתח היציאה לאיסוף פסולת פתרון. ודא שתא המדידה הוא ללא בועות אוויר ולא מזרק בועות אוויר לתוך המערכת. סגור את נמל הכניסה באופן מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את בדיקת איכות תא על ידי לחיצה על &quot;אישור&quot;. התוכנה תציג את התוצאות באיכות התא לאחר מספר שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם כל חלקיקים עדיין הם דמיינו במסך החי-המבט של התוכנה או אם התוצאה של בדיקת האיכות היא טובה או גרועה רק, חזרו על שלב 2.3 עד החלקיקים שנותרו יוסרו מתא המדידה. גם לחזור על שלב 2.3 לאחר כל מדידה, כדי למנוע הצטברות של חלקיקים. אם חוזר על הזרקת מים המזוקקת ותא בדיקה אינו מייצרת תוצאה &quot;טובה&quot;, המשך 2.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן השעיה שליטה המכילה pol בגודל nm 200 האחידחלקיקי ystyrene לשמש כדי ליישר את המוקדים של הלייזר ומיקרוסקופ. הוסף טיפה אחת של תרכיז ההשעיה, הניתנת על ידי יצרן המכשיר, 500 מיליליטר של מים מזוקקים כדי לקבל את הריכוז הנדרש כך ש600 ± 100 חלקיקים מוצגים כל מסך בשידור החי-הנוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את ההשעיה היישור למכשיר נת&quot;ע כמתואר בשלב 2.3. לחץ על &quot;אישור&quot; כדי להתחיל יישור אוטומטי, שיגרתי אוטומטי דרכו במערכת באופן אוטומטי למצוא את המיקום האופטימלי של שני מוקדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מופיעה הודעה לפיה המערכת מוכנה כעת לניסויים, לחץ על אישור כדי להתחיל את המדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדי פעם, לנקות את ערוץ התא באופן ידני בין ניסויים על ידי שטיפת התא עם פתרון 30% אתנול. נקה את הערוץ בכל פעם שהתוכנה מציגה דוח שגיאות אוטומטי. </li></ol> 3. מדידה של מדגם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הערוץ עם מים מזוקקים לפני eaמדידת ch מדגם (כמתואר בשלב 2.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את ההשעיה exosome (מוכנה בסעיף 1) לערוץ, כפי שמתואר בשלב 2.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את הפרמטרים העיקריים הבאים בתוכנה בהתאם לצורך: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רגישות. כדי למצוא את טווח הרגישות האופטימלי, לחץ על &quot;מספר החלקיקים לעומת רגישות&quot; כדי להציג עקומה לחלקיקים שנמדדו בכל מסך לרמות רגישות שונות. בחר רמת רגישות לפני השיפוע המרבי של העקומה. רמת רגישות גבוהה יותר מאפשרת הדמיה של חלקיקים יותר קטנים, אלא גם מגבירה את נושאים הקשורים לרעשי רקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהירות מינימאלית. בחר בהירות החל מ -20 למדידת exosome להשתמש בפונקציה זו כמסנן. להסדיר בפרמטר זה עד ריק החוצה בעוצמה חלקיקי פיזור האור. לווסת אותו כדי להגביר חלש פיזור חפצים. להשתנות בהירות בהתאם לצורך לאורך כל הניסוי. הערה: חלקיקים הקלים כלפיזור חזק מדי חפיפה וניתן לשלול מהניתוח בטעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גודל מינימום והמקסימום. להגדיר מסנן דיגיטלי לחסל רעש פיקסל ופיזור לא רצוי מחלקיקים גדולים מדי על ידי ויסות הגודל המינימאלי ומקסימאלי. השתמש במגוון של 10 עד 500 פיקסלים למדידת exosomes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תריס. התאם את משך זמן שהמצלמה פתוחה ל1 / 300 שניות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחיות פרמטרים לקרוא את: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר בין דיגיטלי ומודוס תצוגה אנלוגי בכל נקודה על ידי לחיצה על הכפתור &quot;Live-התמונה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאורך כל הניסוי, לפקח על הבר עצמת פיזור, המציג את מצב הרוויה של המדגם כמחוון צבע מקודד. לא לנתח exosomes אם שורת הפיזור היא אדומה. במקרה כזה לדלל עוד יותר את המדגם כדי להימנע מתופעה זו. אם תנאי הניסוי אוסר מניפולציה של ההשעיה המדגם, מטה-להסדיר את הרגישות או-להסדיר את הבהירות בתוכנה-settings כדי לשפר את תוצאות המדידה. הערה: כאשר דגימות עם ריכוז גבוה מאוד של חלקיקים מנותחות הפיזור יהיה הפתיל חלקיקים בודדים והם נספרים כחלקיק אחד בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב למספר החלקיקים נספרו בשדה ראייה מהתצוגה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הלשונית &quot;המדידה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר הגדרות במערך &quot;האפשרויות לרוץ&quot;. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני כל רכישה, בחר &quot;תנועת המחאה&quot; לבדיקה להיסחף חלקיקי בדיקה חוזרת ונשנית. בצע את הבדיקה לפחות פעם אחת לפני שמתחיל כל הניתוח. אם להיסחף גבוה מ -20 מיקרומטר / sec, לחכות לפני שתמשיך המדידה כך שהמדגם מפסיק לזרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את מספר הניסויים (5) והשהיית הזמן ביניהם (0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע &quot;בדיקה מדגמית&quot; במידת צורך. בדיקה זו היא חלק מהיישור האוטומטי בהליך להתחיל וניתן לחזור לאחר מכן במידת הצורך. </li&gt; </ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף לחץ על הכפתור &quot;רכישת וידאו לרוץ&quot;. בחלון החדש, להגדיר את מספר המחזורים (15) ומספר משרות מדידה (11). הערה: ראש הלייזר ומיקרוסקופ ניתן להעביר לנתח את מספר החלקיקים בשעה 11 בתנוחות שונות. בהתאם לדרישת ניסיוני, להחליט אם הניסוי צריכה להתבצע על עמדה אחת או בעמדות שונות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר את משך הזמן המינימלי חלקיקים יש להיות במעקב לייספר כחלקיק אחד בודד על ידי הגדרת הרזולוציה וידאו (הנמוך). תוצאות רזולוציה נמוכות יותר בזמן קצר יותר מעקב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר שם קובץ ולחץ על &quot;אישור&quot; כדי להתחיל מדידה. </li></ol></li></ol> 4. פרשנות של התוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצג את התוצאות הבאות ופרמטרים המוצגים לאחר מדידה בכרטיסיית &quot;תוצאות&quot;: (1) מספר כולל של חלקיקים לייחס, (2) מספר ממוצע של חלקicles למשרה, ו- (3) ריכוז חלקיקים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג את הטבלה ממוצעת התוצאה ליחס המספרי של גודל חלקיקים (קוטר, שטח ונפח) לשיעור של מספרי חלקיקים, כמו גם ערכים של ממוצע ובידול סטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בטבלת ניתוח שיא אם שיא אחד או יותר קיים בניתוח הגרפי. טבלה זו מציגה את ההתפלגות של חלקיקים שהם קטנים יותר מאשר השיא הראשון או שני בהתאמה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצג את הגרף מחושב לאחר המדידה כדי לראות הפצה של חלקיקים לפי גודל. השתמש בסמלים במצב התצוגה ומעל הגרף כדי לשנות את ההגדרות. </li></ol>

<ol>
	<li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., Bonifacino, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.+Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.+.">Chapter 3. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. .</a> Current protocols in cell biology / editorial board. (3.22), (2006).</li><li>Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+for+proteomic+analyses+and+RNA+profiling.">Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling.</a> Methods in molecular biology. 728, 235-246 (2011).</li><li>Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+RNA-containing+exosomes.">Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.</a> J. Vis. Exp. , e3037 (2012).</li><li>Konokhova, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-scattering+flow+cytometry+for+identification+and+characterization+of+blood+microparticles.">Light-scattering flow cytometry for identification and characterization of blood microparticles.</a> Journal of biomedical. 17, 057006 (2012).</li><li>Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+current+knowledge+of+their+composition,+biological+functions,+and+diagnostic+and+therapeutic+potentials.">Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials.</a> Biochimica et biophysica acta. 1820, 940-948 (2012).</li><li>Sokolova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+exosomes+derived+from+human+cells+by+nanoparticle+tracking+analysis+and+scanning+electron+microscopy.">Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy.</a> Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 87, 146-150 (2011).</li><li>Clayton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+antigen+presenting+cell+derived+exosomes,+based+on+immuno-magnetic+isolation+and+flow+cytometry.">Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry.</a> Journal of immunological. 247, 163-174 (2001).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> Amer. J. Phys. Renal Phys. 292, F1657-1661 (2007).</li><li>Carr, B., Warren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Company+profile:+NanoSight:+delivering+practical+solutions+for+biological+nanotechnology.">Company profile: NanoSight: delivering practical solutions for biological nanotechnology.</a> Nanomedicine. 7, 1129-1132 (2012).</li><li>Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal-like+vesicles+are+present+in+human+blood+plasma.">Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma.</a> International immunology. 17, 879-887 (2005).</li></ol>

This work was supported by the institutional funds of the Dept. of Cardiovascular Surgery, Medical Faculty, HHU. The publication costs of this study were provided by Particle MetrixGmbH.

אנחנו מדגימים פרוטוקול מפורט לבידוד exosome מהדם ומעקב ננו-חלקיקים נוכחי כחדשני ושיטה חדשנית למדידת גודל exosome וריכוז בנוזל ביולוגי. בניסויים שהוצגו דם היקפי אדם שימש כמקור exosomes. עם זאת, מקורות אחרים, כגון שתן, כיח, supernatant תרבית תאים, וכו &#39;, יכולים לשמש גם כחומר למבחן. בהתבסס על השונות הביולוגיות של ריכוז exosome בבני אדם, מבחני מאנשים שונים עשויים כוללים ריכוז להפליא משתנה של exosomes. עם זאת, הריכוז של חלקיקים בבדיקת המבחן הביולוגית עלול להיות השפעה על התוצאות. לכן, יש צורך בגישה אמינה וסטנדרטית לדילול של בדיקות. בשיטה המוצגת הפלזמה exosome מכיל נוצרה מ9 מיליליטר של כל דם היקפי. באמצעות צנטריפוגה ההפרש צעדים גלולה exosome הייתה מבודדת מ<html> פלזמה ו 1 מיליליטר מחדש תלויה 5 מיליליטר מים מזוקקים לתוצאה במדגם העבודה של exosomes המושעה. הגדרה מוגדרת מראש זה סיפקה לנו ריכוז נכון של חלקיקים, כלומר, עוצמת פיזור מתאימה במהלך נת&quot;ע. לצד היבט הנפח ודילול, ההרכב של הפתרונות המשמשים גם הוא בעל חשיבות. יש לנו להשתמש במים מזוקקים במשך מחדש ההשעיה הסופית של exosomes. כמובן, עשויה לשמש גם אמצעי תקשורת שונה לצעד הדילול הסופי, בהתאם לדרישות של ניסיוני ההגדרה. עם זאת, במקרה של מדידות zeta פוטנציאל של פתרונות-יוניים, במיוחד כאשר בודקים דגימות עם קיבולת חציצה, דילול זהיר בתנאים חופשיים מערבולת שימושי. לשם ההשוואה הישירה של דגימות מרובות אנו ממליצים לשמור על אותה רמת דילול עבור כל הדגימות. כל ההגדרות, מלבד הרגישות ורזולוצית וידאו ניתן לשנות לאחר מכן על ידי שימוש בתוכנת ZetaView ניתוח. &quot;Jove_content&quot;&gt; למרות שהחוקרים מאמינים כי המערכת הציגה במסמך זה כרגע מייצגת את המכשיר המתאים ביותר, זה לא מערכת נת&quot;ע זמינה רק. מספר הדיווחים הקודמים מועסק מערכות אחרות שחלות אותם עקרונות נת&quot;ע אבל מספקים עיצוב מכשיר אחר שהולך יחד עם כמה תכונות שונות 10. אנו מאמינים כי היבטים מעשיים הנוגעים לטיפול במדגם ושחזור של התוצאות הם בעלי חשיבות מרכזית בבחירת הרצף מתודולוגיים להערכת exosome. כמו כן, אנו מאמינים כי מערכת איתור אידיאלית צריכה לחסל גורמים-תלוי משתמש שעלול להפריע לתוצאות של המדידות. גישת ניתוח exosome שמוצג כאן מקיימת את המבחן של טיפול קל לרמה גבוהה. כיתרון נוסף, הניתוח אוטומטי למחצה של הדגימות מתבצע בתהליך מהיר, שהניבו תוצאות בזמן קצר. הדמיה מקוונת של exosomes מסייעת המנתח לgaברעיון מיידי של מאפייני exosome, למשל, ריכוז ברוטו. בנוסף מאוד פשוט אך אלגנטי לטכניקת המדידה שהוצגה כאן הוא השימוש בנוגדן שכותרתו exosomes והלכידה של קרן הלייזר מפוזרת באמצעות מסנן הקודם מול הגלאי. בדרך זו תת-אוכלוסיות exosome ניתן להבחין על פי אנטיגנים פני השטח ומאפיינים רלוונטיים מבחינה ביולוגית אחרים, כי הם מבחינה טכנית נגישות לצביעת ניאון סלקטיבית. אחד חסרונות של הגרסה הנוכחית של מכשיר מעקב חלקיקים שלנו הוא העובדה כי ברמות רגישות גבוהות מאוד חפצים כגון רעשי רקע יכולים להיות נוכחים, המבוסס על קיר ערוץ תא. פתרון טכני ושיפור למערכת הנוכחית עשויים להיות זמינים בעתיד הקרוב. על ידי השתקפויות שיטה זו של אור לייזר הפיזור על קיר הערוץ יקטן, ובכך להגדיל<html> הדיוק של האותות הנמדדים ונתונים המתקבלים והוריד את המגבלה של זיהוי. אף על פי הפרוטוקול המשמש כיום לבידוד exosome מבוסס היטב ויש לו מכשיר מעקב חלקיקים מיושם רזולוציה מדויקת להפליא עם התפלגות גודל נמוכה יותר של 30 ננומטר, אין ערובה לכך שהחלקיקים זוהו אכן exosomes לגמרי נכון. חלקיקים אחרים, כגון שברי תאים מתים או קומפלקסי חלבונים גדולים יותר עשויים גם להיות נוכחים בהשעית exosome ולהוביל לאותות חיוביים כוזבים. שיטה אמינה אחד שבו &quot;זיהום&quot; כזה יכול להיות שלילי עשוי להיות במיקרוסקופ אלקטרונים (EM), או EM שידור או EM סריקה. למרבה הצער, אין סמן כללי וספציפי לexosomes זוהה עד כה, אם כי מספר סמני משטח הציעו בעבר זכה כמות הולך וגדלה של תשומת לב, כוללים tetraspanin (Tspan), CD81, C63, CD9, וכו &#39;11. &quot;&gt; ללא קשר להתקדמות בעתיד של מחקר על הביולוגיה exosome, בעיקר בכל הנוגע סמנים ספציפיים exosome, הפרוטוקול המוצג כאן יספק שיטה רבת עוצמה לבידוד וזיהוי של exosomes. ריכוז וגודל יכולים להיקבע בקלות בסיוע תוכנה אופנה פשוטה. התוספת של סמני ניאון סלקטיבית או נוגדני fluorophore בשילוב צפוי לשפר עוד יותר את היישומים האפשריים של הגישה שהוצגה של נת&quot;ע.

הפונקציה של exosomes במחזור המדויקת נשארה לא ידועה לתקופה ארוכה של זמן. אפילו עכשיו מנגנון נתיב המלא של exosomes לא מובן לחלוטין. מאז exosomes לשאת אנטיגנים, חלבונים ו- RNA (mRNA ומירנה) המתייחס לתא שלהם ההורים ממוצא, תפקידם כמשדרי איתות תאי תאים יש בעיקר ניתנו עדיפות. שיטות שונות רבות תוארו בספרות לבידוד וזיהוי כמותי של exosomes 1,2. עם זאת, לא הושגה הסכמה על &quot;תקן זהב&quot;. בינתיים רוב המדענים הפועלים בתחום מחקר exosome מסכימים ששיטה של ​​בידוד עקבי היא מוצדקת מאוד כדי להשיג רמה גבוהה יותר של השוואתיים בין דוחות ומחקרים שונים. מיון הקרינה מופעל תאים (FACS) הוא הכלי הנפוץ והשכיח ביותר לניתוח exosome 3. FACS יש בןefit ש, באמצעות תיוג הקרינה, ניתן להשוות תאים ממקורות שונים בצעד אחד. החסרונות העיקריים של FACS הם ששיטה זו אינה רגישה מספיק כדי לזהות חלקיקים קטנים מ -0.5 מיקרומטר 4, ואילו exosomes הן בדרך כלל בין 30-120 ננומטר בקוטר 5, אפילו פחות כדי למדוד את הגודל שלהם. במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) ומיקרוסקופי אלקטרונים הילוכים (TEM) הם כלים אחרים לניתוח גודל חלקיקים ומורפולוגיה של exosomes. עם זאת, שני SEM וTEM החסרון כי הכנת הדגימות היא, בשתי השיטות כרוכות בצעדים עתיר עבודת זמן רב וכל אחד יש סיכון מסוים של דור חפץ. לא השיטה מתאימה לתפוקת מדגם גבוהה ואפיון של כמה אלפי חלקיקים בודדים של מדגם אחד. יתר על כן, ניתוח כמותי לשגרה יומית קלינית שבו דגימות יש לעתים קרובות כדי להיות מנותח בו זמנית, או לפחות בפרק זמן קצר מאוד הואקשה לביצוע. טכניקות דור חדשות עכשיו מאפשרות לנו לנתח exosomes ללא עבודה אינטנסיבית לפני ההכנה (SEM למשל, איכות הסביבה). הטכניקות המודרניות אלה הן עדיין לא נוחים לניתוח השעיות נפח גדולים המכילות exosomes לקבוע מספר הממוצע שלהם והתפלגות גודל 6. שיטה נוספת רגישה מאוד להדמיה וניתוח של exosomes היא ניתוח מעקב ננו-חלקיקים (נת&quot;ע). שיטה זו מנצלת את שני עקרונות שונים של פיסיקה. ראשית, חלקיקים מזוהים על ידי האור מפוזר כאשר הם מוקרנים עם קרן לייזר. התופעה השנייה ידועה בשם התנועה בראונית, לפיה דיפוזיה של חלקיקים שונים בהשעית נוזל עומד ביחס הפוך לגודלם. במקרה האחרון התנועה תלויה גם בטמפרטורה והצמיגות של הנוזלים. עם זאת, שיעור זה קשור באופן ישיר לגודל חלקיקים ומשמש את נת&quot;ע. באמצעות רךניתוח מבוסס-ware, תמונות דיגיטליות של אור מפוזר מחלקיקים בודדים נרשמות. חלקות של כתמים מפוזרים אור ומהירות תנועה שלהם לספק נתונים המאפשרים קביעת ספירת חלקיקים כוללת והפצת גודל. טכניקה זו היא חזקה במיוחד לניתוח חלקיקים בקוטר ממוצע של פחות מ -100 ננומטר. מדידות הגודל וריכוז מבוצעות עם ראונית ZetaView ואלקטרופורזה Motion Video ניתוח מיקרוסקופים. זהו מכשיר אוטומטי למחצה שולחן ננו-חלקיקים העליונים ניתוח לדגימות נוזליים (להלן ככלי מעקב אחר החלקיקים). זה מורכב של מנתח מעקב החלקיקים, כמו גם מחשב נייד עם התוכנה המשמשת לניתוח נתונים. דגימות ביולוגיות הטרוגנית הן כמתאימות לשיטה זו כמתלים הומוגנית יותר של חלקיקים אורגניים. מיקרוסקופ פיזור לייזר עם מצלמת וידאו משמש לזיהוי של חלקיקים ולobservation של תנועתם. בעוד ציר מיקרוסקופ הוא אופקי וממוקד לערוץ התא המלא בהשעיה מכילה exosomes, קרן הלייזר בכיוון אנכית. החלקיקים מוקרנים על ידי פיזור לייזר האור, אשר נרשם תחת 90 מעלות במצלמת וידאו דיגיטלית באמצעות מיקרוסקופ (איור 1). עוצמת האור המפוזר מאפשרת תצפית של חלקיקים גדולים יותר בקוטר 60 ננומטר. בסביבה כזו הבהירות של חלקיק היא לא האינדיקציה היחידה של גודל חלקיקים. כאשר אין שדה חשמלי מוחל, תנועת חלקיקים כדלקמן רק תנועה בראונית ועשויה לשמש כמדד לחישוב גודל חלקיקים. עם זאת, המכשיר הוא גם מסוגל החלת שדה חשמלי על פני ערוץ התא. כאשר נתון תחום זה, את הפוטנציאל, הקוטביות ורמת יונית-אחראי exosomes המושעה להיות גורמים נוספים לכיוון התנועה שלהם. מהירות וכיוון בתוצאת מו electrophoreticהיסטוגרמה bility. תוך מציאת שיטה אופטימלית לניתוח exosomes המבודד בעיה אחת, עוד אחד נמצא בבידוד היעיל של exosomes מהתחומים שונים, כגון דם, מיימת, שתן, חלב, מי שפיר או תקשורת סלולארי. שיטות שונות תוארו עד כה, אשר מבוססות על ultracentrifugation 1, ריאגנטים תעשייתיים הפרדה (כגון Exoquick) 7, חרוזים מגנטיים לאנטיגן העסקת הפרדה 8 או 9 אולטרה שלבים. בפרוטוקול זה אנו מראים את כל התהליך של בידוד exosome באמצעות ultracentrifugation ולהראות כיצד לנתח את exosome כתוצאה מכיל השעיה באמצעות מכשיר מעקב אחר חלקיקים. שיקולים ספציפיים לניתוח exosomes נגזר בינוני פלזמה או תרבית תאים האנושיות מסופקים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="645">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">Name of the Reagent</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Citrate tube</td>
			<td>BD</td>
			<td>364305</td>
			<td>BD Vacutainer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Distilled water</td>
			<td>Braun</td>
			<td>3880087</td>
			<td>Aqua ad iniectabilia</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon tube</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>188271</td>
			<td>PP Tube, Steril 15ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultracentrifugation tube</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>357448</td>
			<td>Microfuge Tube Polyallomer 1,5ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybead</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>07304</td>
			<td>2,6% Solids-Latex 
			Alignment Solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (Filter)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4617053V</td>
			<td>5ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (ZetaView)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606051V</td>
			<td>5ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305180</td>
			<td>BD Blunt Fill Needle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td>16555</td>
			<td>Syringe filter, hydrophilic, 450&#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Material Name&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>L8-M</td>
			<td>Rotor: 70Ti Ser. No E21078</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ZetaView</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>PMX 100, Type 101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td>Rotor: A-4-44</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an innovative method for exosome quantification and size measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

המדגם המשמש להפגנה זה מראה הגדרה אופטימלית למדידה עם רגישות של 85%, לפני השיפוע המרבי של עקומת הרגישות (איור 2). הבהירות, דקות / ערכי מקסימום נבחרו כמומלץ בפרוטוקול. ריכוז של 5.3 חלקיקים / ml x 10 6 נמדדו, ואילו הגודל הממוצע של החלקיקים היה 0.149 מיקרומטר, רובם היו 0.137 מיקרומטר. הערכים שהתקבלו לאחר המדידה ניתן לשמור בדו&quot;ח עם פורמט קובץ של Pdf או כ.txt ליצוא למסד נתונים. הגרף יכול להיות מותאם כמועדף כפי שתואר בפרוטוקול (סעיף 4). רצף הווידאו נשמר גם וניתן להשתמש בם לשימוש מאוחר יותר מחדש ניתוח off-line. עם זאת, בניתוח off-line כגון, ההגדרות מראש רכישת המצלמה לא ניתן לשנות למפרע. כדי למצוא את ההגדרות אופטימליות עבור פרמטר מדידה, אנחנו כאן לתאר האופטימיזציה דואר של הגדרות מכשיר על הדוגמא של תקן גודל קלקר 100 ננומטר. ההשפעה של שני פרמטרים, רגישות ודקות / גודל מקסימלי על הפצת תמונת וידאו וגודל חלקיקים נדונה בפירוט. כל הפרמטרים האחרים מסוכמים בטבלה 1. רושם חזותי של ההשפעה של רגישות (הנעה 50-94) על תמונות אנלוגיות ודיגיטליות הוא מדמיין באיור 3. המידע כמותי נגזר מהתמונות מוצג באיור 4, המבוסס על ההגדרות בטבלה 1, גודל Min = 5 וגודל מקס = 200. מערכת יחסים אופייניים למספר החלקיקים שאותרו מול הרגישות מוצג באיור 4 א. בין 50 ל -90, מספר החלקיקים זוהו עלייה ברגישות ובעלה באופן דרמטי לרגישויות&gt; 90. טווח אופטימלי של רגישות נמצא בין 66 ו -86 (א). הפצות גודל חלקיקים שהושגו עם DIFהגדרות רגישות שונה זו מוצגות באיור 4. הפצות גודל חלקיקים מייצגות את הממוצע של שלוש מדידות בודדות. לנמוכה מדי רגישות (רגישות = 62, עקומה אדומה) רק כמה חלקיקים נותחו וכתוצאה מכך בסטטיסטיקה די גרועה. מספר החלקיקים ניתחו גדל ברגישות ובהגיע אופטימלי בין 70 (עקומה צהובה) ו -86 (עקומת שיזוף). בהמשך הגדיל את יתרון הרגישות להידרדרות של התפלגות גודל חלקיקים עם מספר החלקיקים יורדים והתפלגות גודל הסטה לכיוון גדלים קטנים יותר (רגישות = 94, עקומה כחולה). איור 4C מראה את המגמה של קוטר x50 מבוסס המספר (50% מ חלקיקים קטנים יותר בקוטר זה) כפונקציה של רגישות. במרווח בצבע בז &#39;, RSD של גודל חלקיקים היה פחות מ -8% ותואם את המרווח האופטימלי בא האזורים האדומים מצביעים RSD&gt; 8% כתוצאה מנתונים סטטיסטיים עלובים (רגישות נמוכה מדי) או distri הרחבbutions עם מעבר לגדלים קטנים יותר (רגישות גבוהה מדי). ההגדרות של גודל מינימאלי וגודל המקסימלי הן מסננים להחיל תמונות דיגיטליות על מנת להסיר חלקיקים בגדלים קטנים יותר מגודל נקודת מינימום וגדולים יותר מגודל מקסימלי. בשל היכולת לפזר אור, חלקיקים יוצרים נקודה בגודל מסוים בתמונה דיגיטלית. גודלו של המקום נמדד כמספר הפיקסלים (פיקסלים). כאשר חלקיק מפזר אור טוב מאוד (למשל, חלקיקים&gt; 200 ננומטר או אגרגטים), גודל הנקודה הוא די גדול, למשל,&gt; px 500. גודל הנקודה הוא די קטן (למשל, &lt;10 px) לחלקיקים קטנים (למשל, &lt;20 ננומטר) בתלות בחומר החלקיקים. גודל נקודה (פיקסלים) עשוי שלא להיות להחלפה עם גודל חלקיקים (ננומטר) כפי שהם אינם זהים, ואין קשר ישיר בין שני המשתנים הללו. אופטימיזציה של גודל מינימום ומקס מאפשרת למשתמש לסנן אובייקטים לא רצויים כגון agglomerates (גודל מקסימלי) או קטןאובייקטים כגון רעשי רקע (גודל מינ &#39;). ההשפעה של גודל מינימום / מקסימום בגודל חלקיקי ההפצה של סטנדרטי בגודל 100 ננומטר מוצגת באיור 4D (רגישות = 82). כאשר המרווח מוגדר גדלי נקודה קטנים (למשל, דקות = 1, מקסימום = 52; עקומה כתומה), מספר החלקיקים ניתחו מצטמצם וקוטר x50 מבוסס המספר מעט השתנה לכיוון גדלים קטנים יותר. הגדרה לכתמים גדולים יותר (מינימום = 40, מקסימום = 1000, עקומה אדומה) תוצאות בהתפלגות גודל חלקיקים רחבות הוסטה לעבר גדלים גדולים יותר. על מנת לקבל את המספרים מוחלט שווים של חלקיקים, גבולות המרווח של הפצות שני כתומות ואדומות הותאמו כדי להתאים 80 חלקיקים. ההפצה עם הגדרות אופטימליות (דקות = 5, מקסימום = 200; עקומת שיזוף) מורכבת מחלקיקים 360. סדרת ניסויים מוצלחים בוצעה עם exosomes מבודד על ידי ultracentrifugation ונמדד על ידי נת&quot;ע שימוש במערכת שהוצגה. נתונים שהתקבלו היו מאודעולה בקנה אחד ואישרתי ברמה גבוהה של שחזור. שיטות בידוד אחרות צריכים להראות תוצאות דומות. עם זאת, צעד הדילול זוהה כצעד קריטי במיוחד והשפעתה על המספרים הכולל המחושבים של חלקיקים יש הערכה מחדש. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig1.jpg" /> איור 1. סכמטי של ההתקנה של נת&quot;ע. מיקרוסקופ / ציר הווידאו וקרן לייזר מכוון orthogonally זה לזה, שחצו בחתך ערוץ תא. האור מפוזר על ידי החלקיקים מוצג בחלון &quot;חי-הנוף&quot; של התוכנה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig2.jpg" /> <strong&gt; מספר איור 2. חלקיקים לעומת עקומת רגישות. מספר החלקיקים לעומת עקומת רגישות מציג את החלקיקים בעמדה אחת ברגע אחד במהלך סריקת רגישות אוטומטית. הדמיה גרפית זה משמשת כדי לקבוע את ההעדפות הטובות ביותר עבור המדידות הראשוניות. ערך רגישות נבחר לפני השיפוע המרבי של הגרף. חשוב לזכור כי ממצאים אינם בוטלו בניסוי בדיקה זו ויכולים להשפיע על הגרף. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig3.jpg" /> איור 3. השפעה של רגישות על אנלוגי ותמונה דיגיטלית. יזואליזציה של חלקיקים על מסך התצוגה החיה מוצגת לרגישויות בין 50 ל 94 לאנלוגית (שורה העליונה)צפיות ד דיגיטליות (בשורה התחתונה). כאשר הרגישות נמוכה מדי, רק כמה חלקיקים מזוהים (משמאל). ברגישות אופטימלית החלקיקים מופיעים נקודות בודדות כמבודדות היטב אחד מהשני (באמצע). בחלקיקי רגישות גבוהים יחסית יחד למזג מובילים לאיכות תמונה ירודה (מימין). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig4.jpg" /> השפעה של איור 4. דקות רגישות והגדרות גודל מרביות למדגם חלקיקי פוליסטירן 100 ננומטר שליטה (א) מגרש של רגישות לעומת מספר מזוהה של חלקיקים.; המרווח האופטימלי הוא 66-86, לפני השיפוע המרבי של העקומה. הפצות גודל (B) חלקיקים שהושגו עם כמה הגדרות רגישות (62-94); גרפים לנמוכים מדי (62) או גבוה מדי (94) רגישות אינה ממצה את התפלגות גודל חלקיקים במדגם שליטת קלקר 100 ננומטר. קוטר x50 מספר מבוסס לעומת רגישות (ג); השגיאה של x50 במרווח בצבע בז &#39;היא פחות מ 8%, מרווח אופטימלי הוא מ -66 ל86. (ד) השפעה של גודל מינימאלי והמקסימאלי על התפלגות גודל חלקיקים; פרמטרים אופטימליים (דקות = 5 ומקסימום = 200) ללכוד את החלוקה הנכונה למדגם השליטה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> פרמטרים טרום רכישה </td></tr><tr><td> רגישות </td><td> משתנה </td></tr><tr><td> תריס </td><td> 40 </td></tr><tr><td> קצב פריימים </td><td> 30 fps </td></tr><tr><td> רזולוציה </td><td> הייGH </td></tr><tr><td> מחזורים </td><td> 10 </td></tr><tr><td> רכישות מרובות </td><td> 3 </td></tr><tr><td> עמדה </td><td> 1 </td></tr><tr><td colspan="2"> פרמטרים שלאחר רכישה </td></tr><tr><td> דקות בהירות </td><td> 30 </td></tr><tr><td> גודל מקסימלי </td><td> משתנה </td></tr><tr><td> גודל דקות </td><td> משתנה </td></tr></tbody></table> סיכום 1. טבלה של פרמטרים של לפני ואחרי רכישה להגדרה של מכשיר מעקב אחר חלקיקים.

Watch this Scientific Journal Video about An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement at JoVE.com

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

שיטה חדשנית לExosome כימות ומדידה גודל

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

an-innovative-method-for-exosome-quantification-and-size-measurement

Research

JoVE Journal

Biology

30.6K Views.  Heinrich-Heine-University Dusseldorf. A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Video: An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

שיטת מדידה של קינטיקס Fusion ויראלי ברמה חלקיק יחיד

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), and delta-cells (somatostatin) that are embedded in the exocrine tissues and comprise 1-2% of the entire pancreas. There is a close correlation between body and pancreas weight. Total beta-cell mass also increases proportionately to compensate for the demand for insulin in the body. What escapes this proportionate expansion is the size distribution of islets. Large animals such as humans share similar islet size distributions with mice, suggesting that this micro-organ has a certain size limit to be functional. The inability of large animal pancreata to generate proportionately larger islets is compensated for by an increase in the number of islets and by an increase in the proportion of larger islets in their overall islet size distribution. Furthermore, islets exhibit a striking plasticity in cellular composition and architecture among different species and also within the same species under various pathophysiological conditions. In the present study, we describe novel approaches for the analysis of biological image data in order to facilitate the automation of analytic processes, which allow for the analysis of large and heterogeneous data collections in the study of such dynamic biological processes and complex structures. Such studies have been hampered due to technical difficulties of unbiased sampling and generating large-scale data sets to precisely capture the complexity of biological processes of islet biology. Here we show methods to collect unbiased "representative" data within the limited availability of samples (or to minimize the sample collection) and the standard experimental settings, and to precisely analyze the complex three-dimensional structure of the islet. Computer-assisted automation allows for the collection and analysis of large-scale data sets and also assures unbiased interpretation of the data. Furthermore, the precise quantification of islet size distribution and spatial coordinates (i.e. X, Y, Z-positions) not only leads to an accurate visualization of pancreatic islet structure and composition, but also allows us to identify patterns during development and adaptation to altering conditions through mathematical modeling. The methods developed in this study are applicable to studies of many other systems and organisms as well.

Novel computer-assisted methods of large-scale procurement and analysis of immunohistochemically stained pancreatic specimens are described: (1) Virtual Slice capture of the entire section; (2) Mass analysis of large-scale data; (3) Reconstruction of 2D Virtual Slices; (4) 3D islet mapping; and (5) Mathematical analysis.

בסיוע מחשב ויזואליזציה בקנה מידה גדול כימות המוניים הלבלב איילט, התפלגות גודל ואדריכלות

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large macromolecular complexes. Compared to X-ray crystallography, it has some unique advantages. First, single particle EM reconstruction does not need to crystallize the protein sample, which is the bottleneck in X-ray crystallography, especially for large macromolecular complexes. Secondly, it does not need large amounts of protein samples. Compared with milligrams of proteins necessary for crystallization, single particle EM reconstruction only needs several micro-liters of protein solution at nano-molar concentrations, using the negative staining EM method. However, despite a few macromolecular assemblies with high symmetry, single particle EM is limited at relatively low resolution (lower than 1 nm resolution) for many specimens especially those without symmetry. This technique is also limited by the size of the molecules under study, i.e. 100 kDa for negatively stained specimens and 300 kDa for frozen-hydrated specimens in general.
For a new sample of unknown structure, we generally use a heavy metal solution to embed the molecules by negative staining. The specimen is then examined in a transmission electron microscope to take two-dimensional (2D) micrographs of the molecules. Ideally, the protein molecules have a homogeneous 3D structure but exhibit different orientations in the micrographs. These micrographs are digitized and processed in computers as "single particles". Using two-dimensional alignment and classification techniques, homogenous molecules in the same views are clustered into classes. Their averages enhance the signal of the molecule's 2D shapes. After we assign the particles with the proper relative orientation (Euler angles), we will be able to reconstruct the 2D particle images into a 3D virtual volume.
In single particle 3D reconstruction, an essential step is to correctly assign the proper orientation of each single particle. There are several methods to assign the view for each particle, including the angular reconstitution1 and random conical tilt (RCT) method2. In this protocol, we describe our practice in getting the 3D reconstruction of yeast exosome complex using negative staining EM and RCT. It should be noted that our protocol of electron microscopy and image processing follows the basic principle of RCT but is not the only way to perform the method. We first describe how to embed the protein sample into a layer of Uranyl-Formate with a thickness comparable to the protein size, using a holey carbon grid covered with a layer of continuous thin carbon film. Then the specimen is inserted into a transmission electron microscope to collect untilted (0-degree) and tilted (55-degree) pairs of micrographs that will be used later for processing and obtaining an initial 3D model of the yeast exosome. To this end, we perform RCT and then refine the initial 3D model by using the projection matching refinement method3.

This article describes a standard method to get a three-dimensional (3D) reconstruction of biological macromolecules using negative staining electron microscopy (EM). In this protocol, we explain how to get the 3D structure of the Saccharomyces cerevisiae exosome complex at medium resolution using the random conical tilt reconstruction method (RCT).

חלקיק יחיד מיקרוסקופית אלקטרונים שיקום במתחם Exosome שימוש בשיטה אקראיים הטיה חרוטי

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Tangential Flow Ultrafiltration: A  &ldquo;Green&rdquo; Method for the Size Selection and Concentration of Colloidal Silver Nanoparticles

Nowadays, AgNPs are extensively used in the manufacture of consumer products,1 water disinfectants,2 therapeutics,1, 3 and biomedical devices4 due to their powerful antimicrobial properties.3-6 These nanoparticle applications are strongly influenced by the AgNP size and aggregation state. Many challenges exist in the controlled fabrication7 and size-based isolation4,8 of unfunctionalized, homogenous AgNPs that are free from chemically aggressive capping/stabilizing agents or organic solvents.7-13 Limitations emerge from the toxicity of reagents, high costs or reduced efficiency of the AgNP synthesis or isolation methods (e.g., centrifugation, size-dependent solubility, size-exclusion chromatography, etc.).10,14-18 To overcome this, we recently showed that TFU permits greater control over the size, concentration and aggregation state of Creighton AgNPs (300 ml of 15.3 &mu;g ml-1 down to 10 ml of 198.7 &mu;g ml-1) than conventional methods of isolation such as ultracentrifugation.19
TFU is a recirculation method commonly used for the weight-based isolation of proteins, viruses and cells.20,21 Briefly, the liquid sample is passed through a series of hollow fiber membranes with pore size ranging from 1,000 kD to 10 kD. Smaller suspended or dissolved constituents in the sample will pass through the porous barrier together with the solvent (filtrate), while the larger constituents are retained (retentate). TFU may be considered a "green" method as it neither damages the sample nor requires additional solvent to eliminate toxic excess reagents and byproducts. Furthermore, TFU may be applied to a large variety of nanoparticles as both hydrophobic and hydrophilic filters are available.
The two main objectives of this study were: 1) to illustrate the experimental aspects of the TFU approach through an invited video experience and 2) to demonstrate the feasibility of the TFU method for larger volumes of colloidal nanoparticles and smaller volumes of retentate. First, unfuctionalized AgNPs (4 L, 15.2 &mu;g ml-1) were synthesized using the well-established Creighton method22,23 by the reduction of AgNO3 with NaBH4. AgNP polydispersity was then minimized via a 3-step TFU using a 50-nm filter (460 cm2) to remove AgNPs and AgNP-aggregates larger than 50 nm, followed by two 100-kD (200 cm2 and 20 cm2) filters to concentrate the AgNPs. Representative samples were characterized using transmission electron microscopy, UV-Vis absorption spectrophotometry, Raman spectroscopy, and inductively coupled plasma optical emission spectroscopy. The final retentate consisted of highly concentrated (4 ml, 8,539.9 &mu;g ml-1) yet lowly aggregated and homogeneous AgNPs of 1-20 nm in diameter. This corresponds to a silver concentration yield of about 62%.

Tangential Flow Ultrafiltration: A  &amp;ldquo;Green&amp;rdquo; Method for the Size Selection and Concentration of Colloidal Silver Nanoparticles

Tangential flow ultrafiltration (TFU) is a recirculation method used for the weight-based separation of biosamples. TFU was adapted to size-select (1-20 nm diameter) and highly concentrate a large volume of polydisperse silver nanoparticles (4 L of 15.2 &mu;g ml-1 down to 4 ml of 8,539.9 &mu;g ml-1) with minimal aggregation.

Ultrafiltration זרימה משיק: שיטה &quot;ירוקה&quot; לבחירת הגודל והריכוז של חלקיקי כסף Colloidal

Nowadays, AgNPs are extensively used in the manufacture of consumer products,1 water disinfectants,2 therapeutics,1, 3 and biomedical devices4 due to ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

שיטה משופרת למדידה מדויקת והמהירה של טיסה בביצועים<em&gt; דרוזופילה</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One of the primary risk factors of EAC is Barrett&#8217;s esophagus (BE), a metaplastic change of the normal squamous esophagus in response to chronic heartburn. Despite the well-established connection between EAC and BE, interrogation of the molecular events, particularly altered signaling pathways involving progression of BE to EAC, are poorly understood. Much of this is due to the lack of suitable in vitro models available to study these diseases. Recently, immortalized BE cell lines have become commercially available allowing for in vitro studies of BE. Here, we present a method for immunofluorescent staining of immortalized BE cell lines, allowing in vitro characterization of cell signaling and structure after exposure to therapeutic compounds. Application of these techniques will help develop insight into the mechanisms involved in BE to EAC progression and provide potential avenues for treatment and prevention of EAC.

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&amp;#8217;s Esophagus Cells

There is a discernible need for improved information on molecular drivers of Barrett&#8217;s Esophagus. Immunofluorescent staining is a useful technique for understanding the effects of cell signaling on cell morphology. We present a simple, effective protocol for the use of immunofluorescent staining to assess therapeutic treatment in Barrett&#8217;s Esophagus cells.

שיטת Immunofluorescent לאפיון של תאי הוושט של בארט

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

שיטה קלה הצמח Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. Three-dimensional (3D) cell culture techniques are a recent innovation developed to address the shortcomings of adherent cell culture. While several techniques for generating tissue analogues in vitro have been developed, these methods are frequently complex, expensive to establish, require specialized equipment, and are generally limited by compatibility with only certain cell types. Here, we describe a rapid and flexible protocol for aggregating cells into multicellular 3D spheroids of consistent size that is compatible with growth of a variety of tumor and normal cell lines. We utilize varying concentrations of serum and methyl cellulose (MC) to promote anchorage-independent spheroid generation and prevent the formation of cell monolayers in a highly reproducible manner. Optimal conditions for individual cell lines can be achieved by adjusting MC or serum concentrations in the spheroid formation medium. The 3D spheroids generated can be collected for use in a wide range of applications, including cell signaling or gene expression studies, candidate drug screening, or in the study of cellular processes such as tumor cell invasion and migration. The protocol is also readily adapted to generate clonal spheroids from single cells, and can be adapted to assess anchorage-independent growth and anoikis-resistance. Overall, our protocol provides an easily modifiable method for generating and utilizing 3D cell spheroids in order to recapitulate the 3D microenvironment of tissues and model the in vivo growth of normal and tumor cells.

Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions.

שיטת Aggregation Cell יעילה וגמישה עבור הפקת 3D אליפטית

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODLAY: שיטה בקנה מידה גדול עבור כימות רב פרמטר של גידול שמרים

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

הקמת מערכת התרבות pH חומצי חוץ-תאית

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...