나노플라스몬 강화산란 또는 nPES는 시간이 많이 소요되고 노동 집약적인 외정신 정제 단계를 건너뛸 수 있는 외과 생검에 대한 간단하고 비침습적인 대안으로, 외성 분석의 적용을 임상 설정으로 확대한다. 이러한 nPES 분석은 별도의 절연 및 정화 단계를 필요로 하지 않는 엑소좀의 외부 막에 대한 특정 바이오마커를 분석하는 신속한 절차이다. 우리는 이 분석에 대한 아주 작은 임상 견본이 필요합니다.
따라서, 이 방법은 유전자 조작 또는 PDX 마우스 모델을 연구하기 위해 nPES의 사용을 확장할 수 있다. 이 프로토콜에는 몇 가지 단계가 있어 어려워 보일 수 있습니다. 그러나 몇 가지 연습 실행으로 기본적인 습식 실험실 기술을 가진 모든 사람이 성공적으로 nPES를 수행하는 법을 배울 수 있습니다.
절차를 시작하려면 NeutrAvidin 기능성 금 나노로드의 서스펜션 40 마이크로리터를 200 마이크로리터의 감기, pH 7 인산염 완충식 식염수와 결합합니다. 10 분 동안 섭씨 4도에서 8500 g에서 혼합물을 원심 분리하고 상체를 제거합니다. 이 세척 과정을 두 번 더 반복한 다음 차가운 PBS의 40 마이크로 리터에서 나노로드를 다시 중단하십시오.
다음으로, 150마이크로리터의 콜드 PBS와 10마이크로리터를 적절한 생체화 항체의 밀리리터 당 0.5밀리리터 용액을 현탁액에 추가한다. 항체-컨쥬게이드 골드 나노로드를 얻기 위해 섭씨 4도에서 2시간 동안 섞는다. 나노로드를 차가운 PBS의 200 마이크로리터 부분에서 각각 10분 동안 섭씨 4도에서 6500배씩 원심분리하여 3회 세척합니다.
그 후, 차가운 PBS의 200 마이크로 리터에서 세척 된 항체 - 공액 나노로드를 다시 중단하고 최대 24 시간 동안 섭씨 4도에 저장합니다. 슬라이드 를 준비하기 시작하려면, PBS에서 밀리리터 당 025 밀리그램에 원하는 엑소좀 포획 항체를 희석. 파이펫 이 용액의 마이크로리터 1개는 광학 등급 유리로 뒷받침되는 단백질 A/G 처리 슬라이드의 각 웰에 넣습니다.
그런 다음 슬라이드를 가습 상자로 옮겨 인큐베이션 중에 우물이 건조되지 않도록 합니다. 포획 항체를 고정하기 위해 1시간 동안 섭씨 37도에서 슬라이드를 배양합니다. 그런 다음 남은 용액을 흡인하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다.
PBS의 마이크로리터 1개를 3번 첨가하고 흡입하여 우물을 씻으시면 됩니다. 다음으로 PBS 기반 차단 버퍼 1마이크로리터로 각 웰을 빠르게 로드하고 슬라이드를 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 약 15개의 샘플을 실행할 때 차단제의 증발을 피하기 위해 차단 버퍼를 5분 이내에 120개 웰에 로드하려면 단일 채널 파이펫을 사용해야 합니다.
슬라이드 차단 중에 항체-공액 금 나노로드의 용액을 준비하기 시작합니다. 차단 마감 전에 약 30 분, 실온 수조에서 플라즈마 또는 혈청 샘플을 빠르게 해동하십시오. 해동된 샘플을 30초 동안 소용돌이어 서스펜션이 균일하게 유지되도록 합니다.
그런 다음, 원심분리는 단백질 응집체 및 기타 이물질을 침전시키기 위해 15분 동안 500배 g에서 샘플을 원심분리합니다. 상체의 10 마이크로 리터 알리쿼트를 신선한 튜브로 옮기고 PBS로 일대일 희석을 합니다. 희석된 샘플을 부드러운 소용돌이 또는 반전으로 적절히 섞는다.
슬라이드 차단이 완료되면 블로킹 버퍼를 흡인하고 PBS의 1 마이크로리터 부분으로 우물을 세 번 세척합니다. 즉시 우물당 1개의 마이크로리터와 샘플당 8개의 복제로 샘플을 우물에 적재합니다. 엑소솜 표준을 동일한 방식으로 적절한 우물에 로드합니다.
슬라이드를 섭씨 4도에서 냉장고에 12~18시간 동안 배양합니다. 그런 다음, 우물을 흡인하고 PBS의 마이크로 리터 1개씩 한 번씩 잘 씻는다. 항체-컨쥬게이드 골드 나노로드 서스펜션의 마이크로리터 1개를 각 웰에 적재하고, 슬라이드를 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양한다.
그 후, 나노로드 서스펜션을 흡인시키고, 믹서를 사용하여 10분 동안 1%폴리소르바테 20으로 보충된 PBS에서 슬라이드를 세척한다. 그런 다음, 우물을 흡인하고, 회전 믹서에 10 분 동안 탈온 물에 슬라이드를 씻어. 물을 제거하고 슬라이드가 깨끗한 페트리 접시에 공기 건조한 후 어두운 필드 현미경으로 슬라이드를 가져 오도록하십시오.
다크 필드 유전 침지 콘덴서, 4 배 목표 및 전동 스테이지가 장착 된 반전 현미경을 설정합니다. 현미경을 디지털 카메라를 통해 컴퓨터에 연결하고 이미징 소프트웨어를 엽니다. 그런 다음, 현미경 단계에 샘플 슬라이드를 거꾸로 놓고, 응축기 렌즈가 슬라이드에 닿는 작은 침지 오일 한 방울을 적용합니다.
이미징 소프트웨어에서 현미경을 통해 뷰를 표시합니다. 고농도 표준에 대해 노출 시간을 잘 조정하여 이미지가 포화되지 않도록 합니다. 그런 다음 큰 이미지를 스캔하기 위한 도구를 열고 목표 배율을 10배로 설정합니다.
스테이지 이동 중에 활성 셔터를 닫고 각 캡처 전에 20밀리초를 기다립니다. 스티치 중첩을 20%로 설정하고 최적의 경로를 통해 스티치를 선택합니다. 스캔에서 큰 이미지를 만들도록 선택합니다.
스캔을 시작할 때 수동으로 초점을 맞출 수 있도록 카메라를 설정하고 20개 필드마다 자동 단계별 포커스를 사용하도록 설정합니다. 그런 다음, 대상 스캔 필드에 대한 왼쪽, 오른쪽, 위 및 하단 한계를 설정하고, 현미경 스테이지를 원하는 각 한계로 이동하여 스캔 영역을 정의하도록 선택한다. 다음으로 초점, 응축기 및 영역 조명을 조정하여 명확하고 조명이 잘 켜진 이미지를 얻습니다.
만들 이미지 파일의 이름을 지정하고 검사를 시작합니다. 완료되면 이미지를 열고 1/8 배율로 저장합니다. 이미지 분석 소프트웨어를 엽니다.
그런 다음 플러그인 메뉴를 열고 DSM 스캔을 클릭하고, 열 및 행 수를 정의하고, 크기 조정 비율을 25로 설정하고, 스팟 직경을 픽셀단위로 설정하고, 직경 범위를 32로 설정하고, 픽셀 단위로 증가 직경을 설정합니다. 낮은 및 높은 DSM 제한을 0및 62로 설정하고 인접한 거리를 100으로 설정하고 빼기 바이어스를 0으로 설정합니다. DSM 알고리즘을 실행하고 결과 데이터를 저장합니다.
DSM 분석 기술은 마이크로리터 당 0.24에서 1.2 마이크로그램에 이르는 직렬 희석 PANC-1 엑소솜 샘플에 걸쳐 좋은 재현성을 보였다. 금 나노로드와 외성 단백질 농도로부터의 산란 반응 사이에서 강한 선형 상관관계가 관찰되었다. 암 관련 바이오마커 EphA2를 발현하는 혈청 엑소좀의 풍부에 있는 중요한 다름은 췌장암 환자와 건강한 환자 사이에서 관찰되었다.
차단제를 이후로 추가한 것에서 빠르고 정확한 파이펫팅은 시료의 증발, 교차 오염 도입 및 슬라이드 표면 을 긁는 것을 방지하는 데 매우 중요합니다. 이 절차에 따라, 우리는 관심의 외경 바이오 마커의 발현과 연구되고있는 질병의 다른 단계 사이의 상관 관계를 조사하기 위해 통계 분석을 수행합니다. 이 기술을 확립한 후에, 우리는 초기 단계 췌장암을 위한 엑소솜 biomarkers를 찾아내고 있습니다.
현재, 우리는 암과 감염 질병의 그밖 모형으로 이 발견을 확장하고 있습니다. 일반적으로, 이 분석에서 취급된 견본은 특별한 안전 훈련을 필요로 하는 암 세포주에서 참을성 있는 견본 또는 정제된 엑소솜 견본입니다.
