עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים: NIH R21 EB021870-01A1, על ידי ה-NSF מחקר פרויקט מענק: 1517110.

1. מיפוי Fastq קבצים
הערה: התוכנה DEEPN, כמו גם תוכניות רבות ביואינפורמטיקה להשתמש DNA רצף נתונים שבו כל רצף לקרוא מופה עבור המיקום בהפניה הדנ א. מגוון רחב של תוכניות מיפוי יכול לשמש עבור זה כולל MAPster הממשק כאן העושה את התוכנית HISTAT2 כדי לייצר .sam קבצים המשמשים בצעדים העוקבים.
<ol><li>למפות את הנתונים רצף הגירסה הנכונה של הגנום. עבור ספריות Y2H ממוצא העכבר, השתמש הגנום mm10 UCSC; עבור אלה באמצעות גנים אנושיים, להשתמש הגנום הפניה UCSC hg38, עבור גנים האפייה , השתמש הגנום הפניה UCSC SacCer3.</li>
	<li>
התקן MAPster.
	<ol>
<li>MAPster תוכנה להוריד ולהתקין. התוכנה ניתן למצוא באמצעות דפדפן אינטרנט במקומות הבאים: https://github.com/emptyewer/MAPster/releases. HISAT2 פועל במערכות מבוססות Unix, כגון Apple Macintosh. מסיבה זו, התוכנית MAPster תפעל רק במערכות תואם כגון אפל מקינטוש ולינוקס. הערה: דרישות המערכת עבור Mac אפל הם: OSX 10.10 +, > 4gb זיכרון RAM, > שטח דיסק 500 ג'יגה-בתים, גישה לאינטרנט לצורך הורדת הפניה הגנום. משתמשים, ייתכן שיהיה עליך להתייעץ עם המוסדיים אותו אדם אם הארגון שלהם כולל פרוטוקולי אבטחה הגבלת זכויות והרשאות של מנהל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הזן את הקבצים הנדרשים ואת הפרמטרים באמצעות הכרטיסיה "ראשי" (איור 1). בחר "Pairwise" הלחצן המתאים כדי להזין קבצים כמו זוגות או אינטראקצית עם FASTQ כתבנית קובץ ברירת המחדל.
	<ol>
<li>לניתוח DEEPN, הפעל את האפשרות "Pairwise" כדי "לא פעיל" כדי להפעיל בתבנית קריאה יחיד.</li>
		<li>טעינת קבצים MAPster פשוט על-ידי גרירה ושחרור לתוך חלון המתאים.</li>
		<li>בחר הפניה מקור ה-DNA/הגנום שמתאים למקור של Y2H טרף ספריית התוספות. אינדקס הגנום של מספר אורגניזמים דגם המפורטים בתיבת "גנום", ניתן באופן אוטומטי להוריד מאתר אוניברסיטת ג'ונס הופקינס מרכז עבור ביולוגיה חישובית. הפניה הגנום יאוחסנו באופן מקומי לשימוש מאוחר יותר.</li>
		<li>לציין את מספר תהליכים במחשב הייתה מוקדשת התוכנית מיפוי תחת התיבה "חוטים", מאז HISAT2 תומך מרובת השרשור. MAPster חפש את המחשב ולהציע את המספר המרבי של מעבדים הזמינים כברירת מחדל.</li>
		<li>ציין שם של קובץ הפלט. שם קובץ זה ישמש לאורך כל התהליך DEEPN אז מומלץ שם קצר אך תיאורי ללא רווח או תווים מיוחדים. ציין תיקיה פלט הקבצים הממופים באמצעות לחצן "ספריית פלט פתוח".</li>
		<li>פעם אחת את הקבצים המתאימים ופרמטרים נבחרו, להוסיף את העבודה מיפוי לתור עבודות באמצעות הלחצן "הוסף את התור". שמות הקבצים בחלון הראשי יכול להיות מחיקתם והחלפתם הקבצים המתאימים למדגם חדש, ניתן להוסיף לתור אחרי מתן שם קובץ פלט התואם.</li>
		<li>לחץ על לחצן "הפעל תור" לאחר כל העבודות מוזנות תור המשימות. הערה: לאחר עבודה מיפוי הושם בתור, בחירת העבודה הזו גורמת קביעות הפרמטר להציג את החלון "העבודה פרמטרים" ואת הצהרת שורת הפקודה עם כל הארגומנטים יוצג בחלון "העבודה הפקודה". האפשרויות פלט כוללות בימוי אם כדי לשמור על קריאות להיכשל ליישר וציון מספר היישורים העיקרי המותר עבור כל קריאה. קובץ פלט המהווה ברירת מחדל של MAPster נמצא בתבנית סאם (למשל קובץ '.sam'). זה יכיל את כל פעולות רצף הקריאה מקבצי ה-fastq שצוין עבור הדגימה כולל אלה שהיו (מיפוי) ולא היו (לא ממופים) ממופים בהצלחה geome שצוין.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Bioinformatic עיבוד באמצעות תוכנת DEEPN
הערה: התוכנה DEEPN עוברת קומפילציה כעת לשימוש עם טרף ספריות המכיל רצפי cDNA העכבר, רצפים cDNA אנושי או רצפי דנ א גנומי cerevisiae ס . DEEPN מקבל את תבנית הקובץ .sam רגיל, באפשרותך לקבל קובץ סאם (.sam) המכיל קריאות ממופים והן שאינן ממופות או קבצים נפרדים עבור כל הקריאות שאינן ממופות וממופים.
<ol><li>DEEPN תוכנה להוריד ולהתקין. התוכנה ניתן למצוא באמצעות דפדפן אינטרנט במקומות הבאים: https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases. בחר איזו גירסה תואמת את פלטפורמת המחשוב ויכולת להורדה. כדי להתקין, פתח את חבילת ההתקנה שהורדת. הערה: גרסאות DEEPN זמינים עבור PC, Mac, ו- Linux sysrems. מערכות PC ו- Mac צריך > שטח דיסק קשיח 500 Gb ו > 4gb זיכרון RAM.</li>
	<li>
פתח את התוכנה DEEPN. מהחלון הראשי (איור 2) בחר את המידע המתאים ספריית טרף מתיבת הבחירה העליונה. בחרו תיקייה לאן הקבצים המעובדים ללכת על-ידי לחיצה על לחצן "תיקיית עבודה" ניווט אל התיקיה/הספריה. אחד ניתן ליצור תיקיה/ספריה חדשה במידת הצורך. לאחר "תיקיית עבודה", DEEPN תיצור שלוש תיקיות המשנה רשאי unmapped_sam_files, mapped_sam_files ו- sam_files.
	<ol>
<li>אם שימוש בקבצי .sam המכיל קריאות ממופים והן לא ממופים כגון אלה הופק באמצעות הגדרות ברירת המחדל של התוכנית MAPster, למקם אותם בתוך תיקיית 'sam_files'. אחרת למקם קבצים .sam unmapped_sam_files ו mapped_sam_files בהתאם.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ליזום עיבוד על-ידי לחיצה על לחצן "ג'ין ספירה + צומת הפוך". הערה: עיבוד יתחיל עם מודול ג'ין ספירת ישתמש מיפוי עמדות לספור כמה קריאות שיתאימו לכל הגנים. הופכים את צומת ואז לחלץ צומת רצפים (רצפי התמזגו ישירות במורד הזרם מהתחום Gal4-הפעלה) מ הקריאות ולזהות אותם באמצעות האלגוריתם הפיצוץ. פעולה זו תיצור קבוצה מלאה של התיקיות בתמונה באיור3. זמן עיבוד תלוי גודל ואת מספר קבצי נתונים רצף ואת מהירות העיבוד של המחשב המשמש. פעמים טיפוסי נע בין 12 – 30 h עבור הנתונים (dataset) ניסיוני של 250 מיליון ~ קורא. ההליך לספור גן וההליך Junction_Make ניתן להתחיל בנפרד על-ידי לחיצה על לחצן "ג'ין ספירת" או על הכפתור "צומת הפוך".</li>
	<li>
הורד והתקן Stat_Maker (https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases). זוהי חבילה ניתוח סטטיסטי מיועד datasets DEEPN שעובד כיום רק במערכות Unix Mac.
	<ol>
<li>פתח Stat_Maker ולחץ על הלחצן 'אימות התקנת' (איור 4). אם מפעיל בפעם הראשונה, Stat_Maker יתקין באופן אוטומטי R, ג'אגים ו- Bioconductor על ידי משיכת משאבים אלה מהאינטרנט. ברגע R, ג'אגים ו Bioconductor מזוהים, Stat_Maker תהפוך לפעילה, לאפשר את המשך קלט משתמש.</li>
		<li>לחץ על הלחצן "בחר את תיקיית" כדי לנווט אל תיקיית העבודה שעיבד DEEPN. Stat_Maker באופן אוטומטי לחפש ולפרט את הקבצים לשם ניתוח סטטיסטי בחלון.</li>
		<li>גרור ושחרר את הקבצים המתאימים מהחלון רשימת קבצים מעל לתוך החלונות קובץ מתחת עבור כל ערכת נתונים וקטוריים וגם פיתיון ועבור כל תנאי הגידול: שלא נבחרו (שלו + המדיה) ונבחר (שלו - המדיה). חשוב, Stat_Maker דורש datasets כפולים עבור ריק וקטור לבד, שתי דגימות של אוכלוסיות שלא נבחרו שתי דוגמאות שנבחרו. זה נותן הערכה של השתנות בתוך הניסוי.</li>
		<li>לחץ על לחצן "הפעל". בהתאם למהירות המחשב, חישוב יימשך בין 5 ל-15 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תוצאות סקירה מהפלט Stat_Maker, אשר מוצבים בתוך תיקיית משנה חדשה בתוך תיקיית העבודה הראשי עם התווית "Stat_Maker תוצאות". הערה: התוצאות נמצאים בקובץ ה-CSV (ערכים מופרדים באמצעות פסיק) שניתן לפתוח במשותף תוכניות גליונות אלקטרוניים. Stat_Maker לדרג כניסות הגן נוטים להיות מועשר באופן שונה בעת הבחירה עם הפיתיון עניין על ריק pTEF-GBD (איור 5). ייערכו גם הוא האחוז של קריאות עבור כל ערכת נתונים בהן תותב ג'ין נמצא במעלה הנהר, במורד הזרם, או בתוך מסגרת קריאה פתוחה, אם הגן נמצא גם בתוך מסגרת קריאה translational נכונה. לעתים קרובות, DEEPN ללכוד חזקים Y2H אינטראקציות של פיתיון עם חלקים cDNA נתון זה אל מחוץ למסגרת שקריאה תקינה של החלבון המתאים או על חלק cDNA זה במורד הזרם של המסגרת המתאימה פתוח-קריאה. סריקה ופלט משולב Stat_Maker מייעל את זיהוי, חיסול של הפיגועים האלה לא רלוונטי.</li>
	<li>
כדי לסקור את הנתונים לגבי כל מועמד פוטנציאלי, פתח את התוכנה DEEPN, בחר את המידע המתאים של ספריית הטרף ואז תיקיית העבודה הנכון באמצעות התיקיה"עבודה".
	<ol>
<li>לחץ על לחצן "הפיצוץ השאילתה". זה טוען חלון חדש (איור 6). בתיבת הטקסט העליונה, הקלד את שם הגן או מספר GenBank NM כדי לבחור את המועמד הגן עניין. שמות גנים אלה תואמים את שמות הרשומים בקובץ הפלט StatMaker. סוג הזן או להחזיר, אשר יוזם אחזור של הגן עניין.</li>
		<li>בחר אילו נתונים (datasets) ישמש עבור ניתוח שימוש בתפריטים "בחר ערכת נתונים". בדרך כלל, אלה כוללים את הווקטור בלבד, פיתיון גדל בתנאים לא בררניים ודוגמאות המדגם פיתיון גדל בתנאים הבחירה. בתחילה, datasets ייקח כמה רגעים כדי לטעון, עם זאת, השאילתה עוקבות של datasets אותו עם גנים שונים יעבור במהירות. Blast_Query יציג את נקודות היתוך לאורך הרצף של עניין, והוא שופע איך כל נקודת היתוך. זה ניתן להציג גם תבנית טבלה באמצעות הכרטיסיה "תוצאות" או עיצוב גרפי באמצעות הכרטיסיה "עלילה". תוצאות אלו ניתן לייצא לקובץ csv באמצעות לחיצה על לחצן "שמור. csv" בפינה הימנית העליונה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. אימות של מועמדים המזוהה על-ידי DEEPN
הערה: המטרה של DEEPN ו- Stat_Maker הוא לזהות גנים המועמד לתת השפעה חיובית הדדית Y2H. אימות אינטראקציות Y2H כזה יכול להיות בוצע באמצעות תבנית מסורתי Y2H בינארית באמצעות פלסמיד פיתיון את עניין לשייך את פלסמיד תחום "טרף" Gal4-הפעלה ריק כמו גם לשייך את פלסמיד טרף נושא השבר הגן/cDNA עניין. . זה לא ריאלי כדי לבודד את פלסמיד בפועל של עניין בתוך התערובת של DNA מבודד מן האוכלוסייה שמרים נתון לבחירה Y2H... עם זאת, אחד יכול שהמפתחות לשחזר מה השבר הגן/cDNA הוא זה מייצר את האינטראקציה Y2H, תחל עבור 5' ו 3' קצוות הרסיס ומעצבים להגביר את מקטע ה-DNA מבודד מן האוכלוסייה שמרים. סעיף זה מתאר כיצד למצוא בקצה 5' ו 3' של השבר טרף המועמד.
<ol><li>פתחו את התוכנה DEEPN ובחרו את הפרמטרים "בחר פרמטר" ואת תיקיית עבודה "בחר לעבוד תיקיית" המתאים לפרויקט. להפעיל את המודול Blast_Query על-ידי לחיצה על לחצן "הפיצוץ השאילתה".</li>
	<li>
הקלד את השם של הגן מעניינים או GenBank שלה "NM" מספר בתיבת הטקסט העליונה. בחר מתוך התפריט הנפתח את ערכת הנתונים התואם באוכלוסייה שמרים שנבחרו על הכל, עניין כדי לאחזר את הטבלה של צומת עמדות תחת הכרטיסייה 'תוצאות'. כברירת מחדל, Blast_Query יורה את עמדות שונות על פי שלהם שפע ב- dataset, לכמת על ידי ppm המספר הכולל של צמתי נמצאו בתוך מסד הנתונים.
	<ol>
<li>תמצאו הנפוץ ביותר למקם את זה "ב ORF" , "במסגרת". הערך עבור מיקום מקביל נוקלאוטיד מיקומו של הגן עם הרצף הפניה NCBI (מס 'NM') נמצאו בתיבת הטקסט העליונה. הרצף הזה יכול להיות שאוחזר GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/) או העתקת תיבת הטקסט התחתון בחלון Blast_Query. הערה: ניתן למצוא לדוגמה איור 6, בחלונית האמצעית. ב- dataset מרכז, 'תוצאות' הצג צומת הנפוץ ביותר: 'מיקום': 867; '#Junctions': 20033.821; 'התחלה שאילתה', 1; תקליטורים: ב ORF; ' מסגרת ': מסגרת. נוקלאוטיד 867 של הרצף הפניה GenBank NCBI NM_019648 הוא ההתחלה של השבר טרף.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אם ההתחלה שאילתה הוא 1, עיצוב 5' סוף המפתח כדי לכלול את נוקלאוטיד המתאים למספר עמדה והרחבת 25 נוקלאוטידים במורד הזרם מהעמדה הזו (איור 7). אם השאילתה להתחיל הוא יותר מ 1, הוא מציין כי יש נוספת נוקלאוטידים בין התחום הפעלה Gal4 לבין הרצף טרף עניין ולהתחיל כי תחל צריכה נוסף במורד הזרם לפי הערך להפעיל שאילתה.</li>
	<li>מן החלון DEEPN לחץ על לחצן "קריאה עומק" תחת "לנתח נתונים". לאחר פתיחת החלון לקריאה עומק, הקלד NCBI רצף (ננומטר) מספר או ג'ין שם ההפניה לתיבת הטקסט העליונה. השתמש בתפריט הנפתח כדי לבחור את ערכת הנתונים הרלוונטיים המכיל את הגן מועשר עניין. השתמש בטבלה משמאל ולהציג הגרפיקה על הזכות לקבוע כמה קריאות נמצאו נתונים התואמים הגן עניין (איור 7ב').</li>
	<li>עיצוב 3' סוף פריימר זה ללכוד את הרצף של השבר ג'ין מחושב על ידי קריאה עומק. אם השפע של קריאות מעבר ORF ו קודון, עיצוב ומהצמיגים תכלול את stop codon והן את האזור רק במעלה הזרם stop codon. אם רצפי הגן לא להרחיב מעבר stop codon, השתמש בטבלה התוצאות למצוא הכי רחוקות 3' באזור זה ניתן להבחין ולהשתמש עמדה זו הרחוק 3' עמדה כדי למקם את המפתח. הערה: התוכנית לקריאה עומק סורקת במרווחי זמן כדי למצוא את רצפי התואמים את cDNA/ג'ין שצוין עניין. זה עוזר לחזות איפה בקצה 5' ו 3' של השבר הטרף הנפוץ ביותר עבור הגן הזה במדגם. תנודות העומק קריאה לאורכו של הרצף הן נורמליות, כפי שניתן לראות באיור7. העומק קריאה ברור בעבר stop codon, מציין כי השבר טרף חורג stop codon, ובכך ומהצמיגים 3' פשוט יכולה להתאים את האזור סביב stop codon.</li>
	<li>
לבצע תגובת ה-PCR 50 µL לכל הגנים. כל התגובה מכילה 25 pmol של כל פריימר ואחורה תואמים את פלסמיד טרף-ספרייה (ראה טבלה של חומרים). תגובות מכילים גם µL 25 של אמינות גבוהה 2 x PCR מיקס מאסטר, µg 5 של דנ א ומים עד 50 µL.
	<ol>
<li>להגביר את תגובות עבור 25 מחזורי עם סיומת פעמים של 3 דקות ב-72 מעלות, חישול טמפרטורה של 55 ° C ל 30 s, ו denaturing ב 98 ° C עבור 10 ס' לפני רכיבה על אופניים על ידי דנטורציה s 30 ב 98 ° C ופעל עם הדגירה 5 דקות ב- 72 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions.">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li><li>Rajagopala, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Protein-Protein+Interactome+Networks+Using+Yeast+Two-Hybrid+Screens.">Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).</li><li>Weimann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Y2H-seq+approach+defines+the+human+protein+methyltransferase+interactome.">A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome.</a> Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).</li><li>Yachie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pooled-matrix+protein+interaction+screens+using+Barcode+Fusion+Genetics.">Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics.</a> Molecular Systems Biology. 12 (4), 863 (2016).</li><li>Trigg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CrY2H-seq:+a+massively+multiplexed+assay+for+deep-coverage+interactome+mapping.">CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping.</a> Nature Methods. , (2017).</li><li>Pashkova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEEPN+as+an+Approach+for+Batch+Processing+of+Yeast+2-Hybrid+Interactions.">DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions.</a> Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).</li><li>Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HISAT:+a+fast+spliced+aligner+with+low+memory+requirements.">HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements.</a> Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).</li><li>Reinert, K., Langmead, B., Weese, D., Evers, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+of+Next-Generation+Sequencing+Reads.">Alignment of Next-Generation Sequencing Reads.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 16, 133-151 (2015).</li><li>Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript-level+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+HISAT,+StringTie+and+Ballgown.">Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biology. 17, 13 (2016).</li></ol>

המחברים אין לחשוף

חבילת התוכנות המתוארים כאן מאפשרת לעבד ולנתח תפוקה גבוהה DNA רצף נתונים ניסוי DEEPN לחלוטין. בתוכנית הראשונה בשימוש הוא MAPster, אשר לוקח את קריאות רצף ה-DNA בקבצים רגילים fastq וממפה את עמדתם על הפניה דנ א לעיבוד הזרם על ידי שורה שלמה של אינפורמטיקה תוכניות כולל את התוכנה DEEPN. השירות של הממשק MAPster ואת ?...

גישה אחת לגלות אינטראקציות חלבון הוא שמרים 2-היברידית (Y2H) וזמינותו, אילו תוכנות המנצלות לרעה את מהונדסים תאי שמרים לגדול רק כאשר חלבון עניין נקשר שבר של אינטראקציה שותפים1. זיהוי של אינטראקציות מרובות Y2H יכול להיעשות עכשיו עם העזרה של רצף תפוקה גבוהה מקבילים מסיבית. מספר תבניות כבר תיאר2,3,4,5 כולל אחד פיתחנו שבו אוכלוסיות מגודלים באצוות בתנאים בחר עבור שמרים המכיל פלסמידים לייצר אינטראקציה חיובית Y2H6. זרימת העבודה אנחנו פיתח, הנקרא DEEPN (דינמי העשרה עבור הערכה של חלבונים רשתות), מזהה interactomes דיפרנציאלית מספריות טרף אותו לזהות חלבונים המקיימים אינטראקציה עם חלבון (או קבוצת המחשבים) אחד vs. חלבון אחר או תחום mutant conformationally נפרדים. אחד הצעדים העיקריים בתהליך זה הוא ראוי עיבוד וניתוח של הנתונים רצף ה-DNA. מידע שאפשר לקרוא על ידי רק ספירת מספר קריאות עבור כל ג'ין גם לפני וגם אחרי הבחירה של Y2H אינטראקציות באופן מקביל ניסוי ה-RNA-seq. עם זאת, מידע מעמיק הרבה יותר יכול להיות מופק אלה נתונים (datasets) כולל מידע על תחום המשנה של חלבון נתון זה הוא מסוגל לייצר אינטראקציה עם Y2H. בנוסף, ואילו הגישה DEEPN היא ערך, ניתוח רבים דוגמת משכפל יכול להיות מסורבל ויקר. בעיה זו הביאו להקלה באמצעות מודל סטטיסטי שפותחה במיוחד עבור DEEPN datasets איפה המספר של משכפל מוגבל6. כדי להפוך עיבוד וניתוח של ה-DNA רצף נתונים (datasets) מהימן, מלא, עמיד, או נגיש לחוקרים ללא מומחיות ביואינפורמטיקה, פיתחנו חבילת תוכניות שיכולות לכסות את כל השלבים של ניתוח.
הסוויטה לעמוד לבד תוכנות הפועלות במחשבים שולחניים כולל MAPster, DEEPN Stat_Maker. MAPster הוא ממשק משתמש גרפי המאפשר שכל קובץ fastq בתור עבור מיפוי הגנום באמצעות תוכנית ' HISAT2 '7, הפקת קובץ .sam תקן לשימוש ביישומים במורד הזרם. DEEPN יש כמה מודולים. זה מקצה וסופרת קריאות המתאים גן מסוים דומה כימות סוג RNA-seq בעזרת המודול "ספירת ג'ין". אותה גם מחלצת את רצפי המתאים בצומת שבין התחום תעתיק Gal4 ואת הרצף טרף, collates את המיקום של צמתים אלה כדי לאפשר בדיקה שלהם על ידי השוואתי טבלאות וגרפים (באמצעות המודול 'Junction_Make') המודול 'Blast_Query' מאפשר בדיקה קלה, כימות, השוואה של הרצף צומת Gal4 לצומת. Stat_Maker מעריך את הקריאות לפי ג'ין העשרת נתונים סטטיסטית כדרך של סדר עדיפויות להיטים Y2H סביר. כאן, אנו נתאר כיצד להשתמש מהתוכנות הללו, לנתח באופן מלא את רצף ה-DNA נתונים Y2H DEEPN הניסוי. גירסאות של DEEPN זמינים לפעול במערכות PC, Mac, ו- Linux. בתוכניות אחרות, כגון התוכנית מיפוי MAPster, מודול הסטטיסטיקה DEEPN Stat_Maker להסתמך על subroutines המופיעה תחת Unix, הינם זמינים רק במערכות Mac ו- linux.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mapster</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/emptyewer/MAPster/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEEPN software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statmaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum computer system</td>
			<td>Apple</td>
			<td></td>
			<td>Mac Intel Core i5 or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>4 Gb RAM or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>500 Gb Disk spce or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>OS 10.10 or higher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Dell</td>
			<td></td>
			<td>Intel i5-7400 or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>4 Gb RAM or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>500 Gb Disk spce or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>Windows 7 or higher</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

informatic analysis of sequence data from batch yeast 2-hybrid screens

אנחנו הסתגלו שמרים 2-היברידית וזמינותו לחשוף בו זמנית עשרות אינטראקציות חלבון ארעי וסטטיים בתוך מסך אחד ניצול רצפי DNA קצר-קריאה תפוקה גבוהה. Datasets רצף וכתוצאה מכך יכול לא רק לעקוב אחרי איזה גנים באוכלוסיה כי הם מועשרים במהלך הבחירה עבור אינטראקציות חיוביות שמרים 2-היברידית, אלא גם לתת מידע מפורט אודות תחומי משנה רלוונטיים של חלבונים מספיק עבור אינטראקציה. כאן, אנו מתארים חבילה מלאה של תוכניות עצמאיות המאפשרות שאינם מומחים לביצוע כל ביואינפורמטיקה, צעדים סטטיסטיים כדי לעבד ולנתח DNA רצף fastq קבצים אצווה שמרים 2-היברידית וזמינותו. השלבים בעיבוד מכוסה על ידי תוכנות אלה כוללים: קריאות רצף 1) מיפוי והספירה המתאים לכל חלבון המועמד מקודד בתוך ספרייה 2-היברידית טרף שמרים; 2) תוכנית ניתוח סטטיסטי המעריכה את הפרופילים העשרה; ו 3) כלים לבחון את המסגרת translational והמיקום בתוך אזור קידוד של כל מועשר פלסמיד מקודד חלבונים שמעצבת את עניין.

מיפוי נתונים fastq: הצעד הראשון למעשה כל הגדרות היישומים כולל DEEPN הפלט הראשוני הוא קובץ של רצף קצר קורא את למפותם על ידי יישור כדי גנומית, transcriptomic, או אחר מפנה דנ א8. לאחרונה, התוכנית יישור HISAT2 פותחה המשתמשת באלגוריתמים אינדקס המדינה-of-the-art כדי להגדיל ב?...

Watch this Scientific Journal Video about Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens at JoVE.com

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

רצף עמוק של אוכלוסיות השמרים שנבחר עבור אינטראקציות חיוביות שמרים 2-היברידית פוטנציאל התשואות שפע של מידע אודות אינטראקציה שותף חלבונים. כאן, אנו מתארים את הפעולה של ביואינפורמטיקה ספציפי כלים ותוכנות מעודכן המותאם אישית כדי לנתח נתונים רצף כזה המסכים.

Informatic ניתוח של נתוני רצף אצווה שמרים 2-היברידית המסכים

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

informatic-analysis-of-sequence-data-from-batch-yeast-2-hybrid-screens

Research

JoVE Journal

Genetics

7.1K Views.  University of Iowa. רצף עמוק של אוכלוסיות השמרים שנבחר עבור אינטראקציות חיוביות שמרים 2-היברידית פוטנציאל התשואות שפע של מידע אודות אינטראקציה שותף חלבונים. כאן, אנו מתארים את הפעולה של ביואינפורמטיקה ספציפי כלים ותוכנות מעודכן המותאם אישית כדי לנתח נתונים רצף כזה המסכים.

Video: Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

מבחני מזווג Conjugative עבור ניתוח רצף ספציפי של חלבוני העברה מעורבים קוניוגציה

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged as a powerful tool for gene-expression analysis and transcriptome mapping. However, handling RNA-Seq datasets requires sophisticated computational expertise and poses inherent challenges for biology researchers. This bottleneck has been mitigated by the open access Galaxy project that allows users without bioinformatics skills to analyze RNA-Seq data, and the Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID), a Gene Ontology (GO) term analysis suite that helps derive biological meaning from large data sets. However, for first-time users and bioinformatics' amateurs, self-learning and familiarization with these platforms can be time-consuming and daunting. We describe a straightforward workflow that will help C. elegans researchers to isolate worm RNA, conduct an RNA-Seq experiment and analyze the data using Galaxy and DAVID platforms. This protocol provides stepwise instructions for using the various Galaxy modules for accessing raw NGS data, quality-control checks, alignment, and differential gene expression analysis, guiding the user with parameters at every step to generate a gene list that can be screened for enrichment of gene classes or biological processes using DAVID. Overall, we anticipate that this article will provide information to C. elegans researchers undertaking RNA-Seq experiments for the first time as well as frequent users running a small number of samples.

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Galaxy and DAVID have emerged as popular tools that allow investigators without bioinformatics training to analyze and interpret RNA-Seq data. We describe a protocol for C. elegans researchers to perform RNA-Seq experiments, access and process the dataset using Galaxy and obtain meaningful biological information from the gene lists using DAVID.

Transcriptomic ניתוח<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; RNA רצף נתונים באמצעות Suite טוקסידו על פרויקט גלקסי

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral gene therapy studies, IS assays, in combination with next-generation sequencing, have been used as a cell-tracking tool to characterize clonal stem cell populations sharing the same IS. For the accurate comparison of repopulating stem cell clones within and across different samples, the detection sensitivity, data reproducibility, and high-throughput capacity of the assay are among the most important assay qualities. This work provides a detailed protocol and data analysis workflow for bidirectional IS analysis. The bidirectional assay can simultaneously sequence both upstream and downstream vector-host junctions. Compared to conventional unidirectional IS sequencing approaches, the bidirectional approach significantly improves IS detection rates and the characterization of integration events at both ends of the target DNA. The data analysis pipeline described here accurately identifies and enumerates identical IS sequences through multiple steps of comparison that map IS sequences onto the reference genome and determine sequencing errors. Using an optimized assay procedure, we have recently published the detailed repopulation patterns of thousands of Hematopoietic Stem Cell (HSC) clones following transplant in rhesus macaques, demonstrating for the first time the precise time point of HSC repopulation and the functional heterogeneity of HSCs in the primate system. The following protocol describes the step-by-step experimental procedure and data analysis workflow that accurately identifies and quantifies identical IS sequences.

This manuscript describes the experimental procedure and software analysis for a bidirectional integration site assay that can simultaneously analyze upstream and downstream vector-host junction DNA. Bidirectional PCR products can be used for any downstream sequencing platform. The resulting data are useful for a high-throughput, quantitative comparison of integrated DNA targets.

דו כיווני Retroviral אינטגרציה אתר PCR מתודולוגיה וניתוח נתונים כמותיים זרימת עבודה

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an excellent model for rapid assessment of whole transcriptome from whole animal or individual cell populations due to the ease of isolation of RNA from large numbers of animals. Here a protocol for global gene expression analysis in zebrafish embryos using RNA sequencing (RNASeq) is presented. We describe preparation of RNA from whole embryos or from cell populations obtained using cell sorting in transgenic animals. We also describe an approach for analysis of RNASeq data to identify enriched pathways and Gene Ontology (GO) terms in global gene expression data sets. Finally, we provide a protocol for validation of gene expression changes using quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR). These protocols can be used for comparative analysis of control and experimental sets of zebrafish to identify novel gene expression changes, and provide molecular insight into phenotypes of interest.

This protocol presents an approach for whole transcriptome analysis from zebrafish embryos, larvae, or sorted cells. We include isolation of RNA, pathway analysis of RNASeq data, and qRT-PCR-based validation of gene expression changes.

הכנת הדוגמא וניתוח של נתונים ביטוי גנים מבוססת RNASeq דג זברה

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת ב באתרו הכלאה (smFISH) ניתוח הנצה גידול וגטטיבי שמרים, מיוזה

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool commonly used in yeast studies. The expression of a number of neurodegenerative disease-associated proteins in yeast causes cytotoxicity and aggregate formation, recapitulating findings seen in patients with these disorders. Here, we describe a method for screening a yeast model of the Amyotrophic Lateral Sclerosis-associated protein FUS for modifiers of its toxicity. Instead of using transformation, this new screening platform relies on the mating of yeast to introduce an arrayed library of plasmids into the yeast model. The mating method has two clear advantages: first, it is highly efficient; second, the pre-transformed arrayed library of plasmids can be stored for long-term as a glycerol stock, and quickly applied to other screens without the labor-intensive step of transformation into the yeast model each time. We demonstrate how this method can successfully be used to screen for genes that modify the toxicity of FUS.

This article presents a mating-based method to facilitate overexpression screening in budding yeast using an arrayed plasmid library.

ביטוי ההזדווגות מבוססי ספריית הקרנה שמרים

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a larger genomic context. Subtractive genomics enables a researcher to isolate a target sequence of interest (T) by comprehensive sequencing and subtracting out known genetic elements (reference, R). The method can be used to identify novel sequences such as mitochondria, chloroplasts, viruses, or germline restricted chromosomes, and is particularly useful when T cannot be easily isolated from R. Beginning with the comprehensive genomic data (R + T), the method uses Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) against a reference sequence, or sequences, to remove the matching known sequences (R), leaving behind the target (T). For subtraction to work best, R should be a relatively complete draft that is missing T. Since sequences remaining after subtraction are tested through quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR), R does not need to be complete for the method to work. Here we link computational steps with experimental steps into a cycle that can be iterated as needed, sequentially removing multiple reference sequences and refining the search for T. The advantage of subtractive genomics is that a completely novel target sequence can be identified even in cases in which physical purification is difficult, impossible, or expensive. A drawback of the method is finding a suitable reference for subtraction and obtaining T-positive and negative samples for qPCR testing. We describe our implementation of the method in the identification of the first gene from the germline-restricted chromosome of zebra finch. In that case computational filtering involved three references (R), sequentially removed over three cycles: an incomplete genomic assembly, raw genomic data, and transcriptomic data.

The purpose of this protocol is to use a combination of computational and bench research to find novel sequences that cannot be easily separated from a co-purifying sequence, which may be only partially known.

גילוי רצף הרומן מאת גנומיקה מופחתים

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and computational approaches. One such method is the yeast one-hybrid (Y1H) assay, in which interactions between TFs and DNA regions are tested in the milieu of the yeast nucleus using reporter genes. Y1H assays involve two components: a &#8216;DNA-bait&#8217; (e.g., promoters, enhancers, silencers, etc.) and a &#8216;TF-prey,&#8217; which can be screened for reporter gene activation. Most published protocols for performing Y1H screens are based on transforming TF-prey libraries or arrays into DNA-bait yeast strains. Here, we describe a pipeline, called enhanced Y1H (eY1H) assays, where TF-DNA interactions are interrogated by mating DNA-bait strains with an arrayed collection of TF-prey strains using a high density array (HDA) robotic platform that allows screening in a 1,536 colony format. This allows for a dramatic increase in throughput (60 DNA-bait sequences against &#62;1,000 TFs takes two weeks per researcher) and reproducibility. We illustrate the different types of expected results by testing human promoter sequences against an array of 1,086 human TFs, as well as examples of issues that can arise during screens and how to troubleshoot them.

Here, we present an enhanced yeast one-hybrid screening protocol to identify the transcription factors (TFs) that can bind to a human DNA region of interest. This method uses a high-throughput screening pipeline that can interrogate the binding of &#62;1,000 TFs in a single experiment.

מסכי אחד-היברידית משופרת שמרים לזהות גורם שעתוק מחייב את רצפי דנ א אנושי

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian cells, this technology represents a novel means to perform genome-wide genetic screens for functional genomics studies. Libraries of guide RNAs (sgRNA) targeting all open reading frames permit the facile generation of thousands of genetic perturbations in a single pool of cells that can be screened for specific phenotypes to implicate gene function and cellular processes in an unbiased and systematic way. CRISPR-Cas screens provide researchers with a simple, efficient, and inexpensive method to uncover the genetic blueprints for cellular phenotypes. Furthermore, differential analysis of screens performed in various cell lines and from different cancer types can identify genes that are contextually essential in tumor cells, revealing potential targets for specific anticancer therapies. Performing genome-wide screens in human cells can be daunting, as this involves the handling of tens of millions of cells and requires analysis of large sets of data. The details of these screens, such as cell line characterization, CRISPR library considerations, and understanding the limitations and capabilities of CRISPR technology during analysis, are often overlooked. Provided here is a detailed protocol for the successful performance of pooled genome-wide CRISPR-Cas9 based screens.

CRISPR-Cas9 technology provides an efficient method to precisely edit the mammalian genome in any cell type and represents a novel means to perform genome-wide genetic screens. A detailed protocol discussing the steps required for the successful performance of pooled genome-wide CRISPR-Cas9 screens is provided here.

מסכי גנטי מבוססי CRISPR במאגר תאים ממיונקים

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the strength of linkage and association mapping methods, which trace the relationship between DNA sequence variants and phenotype across recombinant progeny from matings between individuals of a species. These approaches, although powerful, are not well suited to trait differences between reproductively isolated species. Here we describe a new method for genome-wide dissection of natural trait variation that can be readily applied to incompatible species. Our strategy, RH-seq, is a genome-wide implementation of the reciprocal hemizygote test. We harnessed it to identify the genes responsible for the striking high temperature growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae relative to its sister species S. paradoxus. RH-seq utilizes transposon mutagenesis to create a pool of reciprocal hemizygotes, which are then tracked through a high-temperature competition via high-throughput sequencing. Our RH-seq workflow as laid out here provides a rigorous, unbiased way to dissect ancient, complex traits in the budding yeast clade, with the caveat that resource-intensive deep sequencing is needed to ensure genomic coverage for genetic mapping. As sequencing costs drop, this approach holds great promise for future use across eukaryotes.

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Reciprocal hemizygosity via sequencing (RH-seq) is a powerful new method to map the genetic basis of a trait difference between species. Pools of hemizygotes are generated by transposon mutagenesis and their fitness is tracked through competitive growth using high-throughout sequencing. Analysis of the resulting data pinpoints genes underlying the trait.

מיפוי גנטי של הבדלי התרמוסבילות בין מינים של שמרים באמצעות הגנום ההופכי לניתוח המייזוליסיטי

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...