Enteroids הם אורגנואידים תלת מימדיים שמקורם בתאי אפיתל במעיים. הם אידיאליים לחקר אינטראקציות פיזיולוגיות מורכבות, איתות תאים והגנה על פתוגן מארח. הפרוטוקול שלנו מתאר כיצד לתרבת היכנסים אנושיים לאחר בידוד תאי גזע מעיים מחולים שעברו כריתת מעיים.
ניהול שותף של lipopolysaccharide בתקשורת התרבות שלנו גורם לתגובה דלקתית ב enteroids המוביל לשינויים היסטולוגיים, גנטיים, וביטוי חלבון דומה לאלה שנראו ב enterocolitis נמק אנושי. בהתחשב בכך המחקר של enterocolitis נמק וסוכנים טיפוליים פוטנציאליים הוא מאתגר מבחינה אתית בנושאים אנושיים, במיוחד ילדים, רצוי מאוד לנצל את הרומן הזה, מודל enteroid רלוונטי ביולוגית של דלקת enterocolitis נמק באמצעות רקמת יילודים אנושית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי enteroids מסוגלים לסכם מחדש את סוגי התאים מרובים של אפיתל מעיים אנושי והם מסוגלים להתגבר על המגבלות המוכרות של מודלים בעלי חיים ומערכות מבוססות תאים.
עוזר להדגים את ההליך יהיה כריסטי Buonpane, תושב כירורגית, וקארי יואן, טכנאי מעבדה מהמעבדה שלנו. בזמן האיסוף בסוויטה האופרטיבית, מניחים את דגימת רקמת המעיים הקטנה האנושית ב- DPBS קר. לשטוף את הדגימה ב DPBS קר עד שהוא ברור של דם וצואה.
יש לאחסן את הדגימה במדיום RPMI 1640 בארבע מעלות צלזיוס עד שהיא מוכנה לבידוד קריפטה. כאשר מוכן להמשיך, לבדוק שוב כי הדגימה היא ברורה של צואה ודם. באמצעות מספריים ניתוח עדין להסיר כל עודף שומן או קליפים כירורגיים סיכות.
משקל הדגימה ולכוון חתיכה כי הוא כ 0.75 כדי 2.5 גרם. לאחר מכן, חותכים את הרקמה לחתיכות 0.5 ס"מ וממקמים אותם בצינור המכיל 30 מיליליטר של חיץ כלטינג מספר אחד. לנער במהירות נמוכה במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, לסנן את הרקמה דרך מסננת תא 100 מיקרומטר ולהשליך את הזרימה דרך. מוסיפים את הרקמה המסוננת לצינור המכיל 30 מיליליטר של חיץ כלטינג מספר שתיים. לנער במהירות נמוכה במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לסנן את הרקמה דרך מסנן 100 מיקרומטר ולהשליך את הזרימה דרך. לאחר מכן, להפשיר 500 microliters של מטריצת קרום מרתף על קרח לשימוש מאוחר יותר. מוסיפים רקמה ל-10 מיליליטר של DMEM קר בצינור חרוט 50 מיליליטר ומנערים במרץ ביד במשך 10 שניות.
לסנן את ההשעיה דרך מסננת תאים 100 מיקרומטר ולאסוף את הזרימה דרך. תשאיר את הצינור הזה על קרח. מוסיפים קצת רקמה לעוד 10 מיליליטר של DMEM קר בצינור חרוט נפרד של 50 מיליליטר ומנערים במרץ ביד במשך 10 שניות.
לסנן את ההשעיה דרך מסננת תאים 100 מיקרומטר ולאסוף את הזרימה דרך. חזור על התהליך פעמיים נוספות עד שיש ארבעה צינורות חרוט המכילים זרימה דרך שכותרתו אחת עד ארבע. לאחר מכן, לסנן את הפתרון בצינור מספר אחד דרך מסננת תא 100 מיקרומטר ולהעביר את הזרימה דרך לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר גם שכותרתו מספר אחת.
חזור על תהליך זה עבור צינורות 2 עד 4. צנטריפוגה צינורות 15 מיליליטר ב 200 פעמים G ו בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. במכסה המנוע לזרימה למינארית, הסר את העל-טבעי מכל צינור והשליך אותו.
הימנע משבש את ענן הרקמה מיד מעל גלולה, גם אם זה אומר להשאיר כמה על טבעי מאחור. בכל צינור, פיפטה למעלה ולמטה לאט לערבב את גלולה עם שאריות על טבעי. מעבירים את התערובת מכל צינור לצינור חרוט וצנטריפוגה בודדים של שני מיליליטר ב-200 פעמים G וב-4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
לאחר מכן, להסיר את supernatant ולתלות את גלולה ב 500 microliters של מטריצת קרום מרתף מופשר מראש. השתמש טיפ פיפטה מצוננת להחיל 50 microliters של השעיה זו למרכז באר בצלחת 24 גם. דוגמה זו אמורה להופיע בצורת כיפה.
חזור על תהליך יישום זה תשע פעמים כדי למלא 10 בארות סה"כ. מעבירים את צלחת ה-24 אינץ' לאנקובטור פחמן דו-חמצני ב-37 מעלות במשך 30 דקות כדי לאפשר פילמיזציה. לאחר מכן, להוסיף 500 microliters של מדיה מיניגוט אנושי להשלים לכל באר.
המשך הדגירה באותם תנאים, הקפד להחליף מדיה זו כל יומיים. ראשית, להוסיף 10 microliters של LPS בריכוז של חמישה מיליגרם למיליליטר ל 500 microliters של מדיה מיניגוט אנושי להשלים בכל באר של הצלחת ביום אפס. המשך דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני ולהחליף את המדיה בתוספת כל יומיים עד האיסוף.
כדי להתכונן להטמיע פרפין, תחילה להסיר בעדינות את המדיה, להוסיף מיליליטר אחד של PBS, בעדינות pipette למעלה ולמטה כדי להמיס את מטריצת קרום המרתף תוך הקפדה לא ללטף את enteroids. צנטריפוגה במהירות פחות מ 300 פעמים G במשך חמש דקות כדי גלולה ולאחר מכן להסיר את PBS. הוסיפו 4% paraformaldehyde והניחו את הצינור בצד למשך שעה כדי לתקן בטמפרטורת החדר.
צנטריפוגה במהירות פחות מ 300 פעמים G במשך חמש דקות כדי גלולה ולאחר מכן להסיר את paraformaldehyde. יש לשטוף בעדינות עם מיליליטר אחד של PBS וצנטריפוגה במהירות של פחות מ-300 פעמים G למשך חמש דקות. לאחר מכן הסר את ה- PBS.
חזור על תהליך שטיפה זה עם PBS פעם אחת. מניחים את הכמות הרצויה של ג'ל עיבוד הרקמה לתוך צינור חרוט לחמם אותו באינקובטור אמבטיה יבשה ב 65 מעלות צלזיוס במשך שלוש עד 10 דקות עד שהוא נוזלי. לאחר מכן, מוסיפים את ג'ל עיבוד הרקמה המומסת לכדור ומערבבים בעדינות.
מניחים טבעת שיבוט קטנה לתוך כיסוי. פיפטה ג'ל עיבוד רקמות תערובת enteroid לתוך טבעת שיבוט כי הוא רכוב על כיסוי. אפשרו לג'ל עיבוד הרקמה ולתערובת ה-enteroid להתגבש בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה.
לאחר מכן, להטביע את טבעת השיבוט עם תערובת מוצקה לתוך 70% אתנול כדי להתכונן להטמיע פרפין. מיד לאחר הציפוי, קריפטות המעיים המבודדות הטריות מופיעות כמוטות מוארכים. בתוך שעות enteroids ייקח על מראה עגול.
במהלך הימים הקרובים יתחילו האנואידים ליצור ספירות. ניצנים צריכים להתרחש בין חמישה ל 10 ימים, וזה כאשר אוסף enteroid צריך להתרחש. הכניסות ההולכות וגדלות מפגינות גם קוטביות, המכילה לומן ריכוזי, גבול אפי ותחום בזיליקטרלי.
Enteroids גם להראות שלמות מבנית המיוצגת על ידי cytoskeleton actin חזק. לאחר מספר ימים בתרבות, enteroids מטופלים LBS לחוות אפופטוזיס יותר יש תשואה נמוכה יותר מאשר קבוצת הביקורת. כפי שניתן לראות ב- NEC האנושי במודלים מורין של NEC, ביטוי מוגבר של אגרה כמו קולטן ארבע נמצא ENTEROIDs מטופלים LPS לעומת פקדים.
Enteroids ניתן גם לאסוף עבור RNA והפקת חלבון באמצעות qRT-PCR הוקמה היטב וטכניקות סופג מערבי ביטוי גנים ובידוד חלבון יכול להתבצע.
