엔테로이드는 장 상피 세포에서 유래한 3차원 오르가노이드입니다. 그들은 복잡한 생리적 상호 작용, 세포 신호 및 숙주 병원체 방어연구에 이상적입니다. 우리의 프로토콜은 창자 절제술을 겪고 있는 환자에게서 장 줄기 세포를 격리한 후에 인간 장로이드를 배양하는 방법을 설명합니다.
우리 배양 매체에서 리포폴리사카라이드를 공동 투여하면 뇌토학적, 유전적 및 단백질 발현 변경으로 이어지는 장로이드에 염증반응이 발생합니다. 괴사 장염 및 잠재적 인 치료제의 연구가 인간 과목, 특히 어린이에게 윤리적으로 도전적이라는 점을 감안할 때, 인간 신생아 조직을 사용하여 괴사 장염의 이 소설, 생물학적으로 관련된 장염 모델을 활용하는 것이 매우 바람직합니다. 이 기술의 주요 장점은 엔테로이드가 여러 세포 유형의 인간 장 상피를 회수할 수 있으며 동물 모델 및 세포 기반 시스템의 인식한계를 극복할 수 있다는 것입니다.
수술을 입증하는 데 도움이 크리스티 Buonpane, 외과 거주자, 캐리 위안, 우리의 실험실에서 실험실 기술자가 될 것입니다. 수술 실에서 수집의 시간에, 감기 DPBS에 인간의 작은 장 조직 샘플을 배치. 혈액과 대변이 맑아지 때까지 차가운 DPBS에서 표본을 씻으시면 됩니다.
표본을 RPMI 1640 배지에 섭씨 4도에 저장하여 토굴 격리가 준비될 때까지 보관합니다. 진행 준비가 되면 표본이 대변과 혈액이 명확하지 않다는 것을 다시 확인하십시오. 섬세한 해부 가위를 사용하면 과도한 지방 또는 수술 클립과 스테이플을 제거합니다.
표본의 무게와 약 0.75 ~ 2.5 그램의 조각을 목표로합니다. 다음으로, 조직을 0.5센티미터 조각으로 자르고 30 밀리리터가 들어있는 튜브에 배치합니다. 섭씨 4도에서 15분간 저속으로 흔들어주세요.
그런 다음, 100 마이크로미터 세포 여과기를 통해 조직을 필터링하고 통해 흐름을 폐기한다. 여과된 조직을 30밀리리터의 첼라팅 완충제 2번을 포함하는 튜브에 추가합니다. 섭씨 4도에서 15분간 저속으로 흔들어주세요.
100 마이크로미터 필터를 통해 조직을 필터링하고 흐름을 버립니다. 그 후, 나중에 사용하기 위해 얼음에 지하 막 매트릭스의 500 마이크로 리터를 해동. 50 밀리리터 원추형 튜브에 차가운 DMEM의 10 밀리리터에 일부 조직을 추가하고 10 초 동안 손으로 격렬하게 흔들어.
100 마이크로미터 세포 여과기를 통해이 서스펜션을 필터링하고 흐름을 수집합니다. 이 튜브를 얼음 위에 보관하십시오. 별도의 50 밀리리터 원추형 튜브에 차가운 DMEM의 또 다른 10 밀리리터에 약간의 조직을 추가하고 10 초 동안 손으로 격렬하게 흔들어.
100 마이크로미터 세포 여과기를 통해이 서스펜션을 필터링하고 흐름을 수집합니다. 1~4개의 라벨을 통해 흐름을 포함하는 4개의 원뿔형 튜브가 있을 때까지 두 번 더 프로세스를 반복합니다. 이어서, 100 마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 튜브 번호 1의 용액을 걸러내고 15밀리리터 원뿔튜브로 흐름을 전달하여 도 1위를 표시하였다.
튜브 2~4개에 대해 이 과정을 반복합니다. 원심 분리기 15 밀리 리터 튜브200 시간 G와 섭씨 4도에서 15 분 동안. 라미나르 플로우 후드에서 각 튜브에서 상체를 제거하고 폐기하십시오.
펠릿 바로 위에 조직의 구름을 방해하지 마십시오, 그 뒤에 일부 상체를 떠나 의미하는 경우에도. 각 튜브에서 피펫을 천천히 위아래로 뒤집어 펠릿을 남은 슈퍼네티트와 섞습니다. 각 튜브의 혼합물을 2밀리리터 원심관과 원심분리기는 200회 G와 섭씨 4도에서 20분 동안 전달합니다.
그 후, 상체를 제거하고 미리 해동된 지하 막 매트릭스의 500 마이크로리터에서 펠릿을 재차질한다. 차가운 파이펫 팁을 사용하여 24 웰 플레이트의 우물 중앙에이 서스펜션의 50 마이크로 리터를 적용하십시오. 이 샘플은 돔 모양으로 표시되어야 합니다.
총 10개의 우물을 채우기 위해 이 응용 프로그램 프로세스를 9번 반복합니다. 24개의 웰 플레이트를 37°C의 5%의 이산화탄소 인큐베이터로 30분간 전달하여 중합을 허용합니다. 그런 다음 각 웰에 완성된 500마이크로리터의 인간 미니구트 미디어를 추가합니다.
동일한 조건에서 계속 배양하여 이틀마다 이 미디어를 교체하십시오. 첫째, 10 마이크로리터의 LPS를 밀리리터당 5밀리그램의 농도로 추가하여 0일 0일 플레이트의 각 웰에 완성된 인간 미니구트 미디어의 500 마이크로리터에 넣습니다. 37도에서 이산화탄소 5%로 계속 배양하고 수집까지 이틀마다 보충 된 미디어를 교체하십시오.
파라핀 포함을 준비하기 위해 먼저 미디어를 부드럽게 제거하고 PBS 1 밀리리터를 추가하고 부드럽게 파이펫을 위아래로 사용하여 지하 멤브레인 매트릭스를 용해시키면서 엔테로이드를 분해하지 않도록 주의하십시오. 원심분리기는 5분 동안 300배 미만의 속도로 G를 펠릿한 다음 PBS를 제거합니다. 4%의 파라포름알데히드를 추가하고 실온에서 고치기 위해 튜브를 1시간 동안 따로 놓습니다.
원심분리기는 5분간 300배 미만의 속도로 펠릿을 한 다음 파라포름알데히드를 제거합니다. PBS와 원심분리기 1밀리리터로 5분간 300배 G 미만으로 부드럽게 씻으십시오. 그런 다음 PBS를 제거합니다.
PBS로 이 세척 과정을 한 번 반복하십시오. 원하는 양의 조직 처리 젤을 원상 튜브에 넣고 액체가 될 때까지 섭씨 65도에서 마른 목욕 인큐베이터에 데우십시오. 그 후, 멜트화 된 조직 처리 젤을 펠릿에 넣고 부드럽게 섞습니다.
작은 복제 링을 커버슬립에 넣습니다. 파이펫은 슈피테트 슈가클과 엔테로이드 혼합물을 커버슬립에 장착되는 복제 링에 넣습니다. 조직 처리 젤과 엔테로이드 혼합물을 섭씨 4도에서 1시간 동안 응고하도록 허용합니다.
그런 다음, 클로닝 링을 응고 된 혼합물과 70 % 에탄올로 잠급하여 파라핀 포함을 준비합니다. 도금 직후, 갓 분리된 장 내 지하실은 길쭉한 막대로 나타납니다. 몇 시간 내에 엔테로이드가 둥근 모습을 취합니다.
다음 며칠 동안 엔테로이드는 구체 형성을 시작합니다. 신진은 5~10일 사이에 발생해야 하며, 이는 엔테로이드 컬렉션이 발생해야 하는 경우입니다. 성장하는 장용제는 또한 중앙 집중식 루멘, 정색 테두리 및 기초 영역을 포함하는 극성을 나타낸다.
엔테로이드는 또한 견고한 액틴 세포골격으로 표현되는 구조적 무결성을 보여줍니다. 문화에서 며칠 후, LBS 처리 엔테로이드는 더 많은 자멸을 경험하고 대조군보다 낮은 수율을 가지고있다. NEC의 뮤린 모델에서 볼 수 있듯이, 수용체 4와 같은 통행료의 증가된 발현은 대조군에 비해 LPS 처리 된 엔테로이드에서 발견된다.
엔테로이드는 또한 잘 확립된 qRT-PCR 및 서부 블로팅 기술을 사용하여 RNA 및 단백질 추출을 위해 수집될 수 있고 유전자 발현 및 단백질 절연을 수행할 수 있다.
