במבחנה מודל אנטרואיד אפיקלי-אאוט של אנטרוקוליטיס נמקית

פרוטוקול זה מתאר את המודל הראשון של apical-out in-a-dish ומהווה שיפור קריטי לעומת מודלים אנטרואידיים רוחביים בסיסיים בצלחת בעת יצירת מודלים חוץ-גופיים של טיפולים פוטנציאליים המיועדים למתן אוראלי. שיטה זו מאפשרת גישה למשטח האפיקלי של אנטרואידים. ניתן להוסיף תרכובות למדיית התאים והתרכובות נקלטות באופן אפי כפי שהן היו נקלטות.

חוקרים המעוניינים להקים מערכת חוץ-גופית של דלקת מעיים כדי לבחון טיפולים פוטנציאליים דרך הפה עשויים למצוא טכניקה זו שימושית במיוחד. רקמות שמקורן בגילאים ומינים שונים עשויות לדרוש סטנדרטיזציה נוספת. כך שייתכן שיהיה צורך בחולים תוך קביעת זמני היפוך קוטביות.

להיפוך הקוטביות של אנטרוידים תלת-ממדיים שואפים מדיה מכל באר של צלחת באר 24 של אנטרוידים בזולטרליים תלת-ממדיים מבוססים. הוסף 500 מיקרוליטרים של חמישה מילימולרים קרים כקרח, EDTA או PBS לכל באר של צלחת באר 24 ושבש בעדינות מכנית את תמצית קרום המרתף או כיפת המטריצה החוץ-תאית על ידי פיפטינג למעלה ולמטה חמש עד שש פעמים עם פיפטה P 200. מעבירים את תכולת ארבע הבארות לצינור של 15 מיליליטר.

לאחר מכן להוסיף שמונה מיליליטר של EDTA קר כקרח לחתוך PBS לצינור. להעביר את 20 הבארות הנותרות באותו אופן. דגירה של הצינורות בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה על פלטפורמה מסתובבת או שייקר ב-330 סל"ד.

לאחר הדגירה צנטריפוגה את הצינורות ולהשליך את supernatant מכל צינור. שלב ושטוף את הכדורים עם חמישה מיליליטר של DMEM F12. לאחר מכן צנטריפוגה של התאים תלויים ולהסיר את supernatant לפני הוספת 12 מיליליטר של מדיום ללא אנטיביוטיקה לצינור להבטיח כי כדורי התא הם resuspended.

Pippet 500 microliters של ההשעיה enteroid לתוך כל באר של 24 לוח חיבור נמוך במיוחד היטב. לדגור על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך יומיים עד חמישה ימים או עד האנטרוידים יש קוטביות הפוכה. ביום הראשון לנמנע, העבירו את תכולתן של ארבע בארות של צלחת באר 24 לצינור מיקרו-צנטריפוגה בקוטר 1.5 מיליליטר.

חזרו על הפעולה לכל הבארות הרצויות עם כל טיפול בצינור נפרד. צנטריפוגה את הצינורות ולתלות את הכדור ב 300 microliters של 4% מ aldehyde fixative בטמפרטורת החדר. לאחר 30 דקות לשטוף את הכדורים עם 500 microliters של PBS.

הוסף 500 מיקרוליטר של 0.1% טריטון X 100 לצינורות. לדגור את הצינורות במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מניחים את הצינורות על סיבוב או שייקר ב 200 סל"ד במשך 15 דקות בשתיים עד שמונה מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה האחרונה, להוסיף 500 microliters של 10% NDS ב PBS T לדגור בטמפרטורת החדר במשך 45 דקות. במהלך הדגירה, להכין פתרון נוגדנים ראשוני. למחרת מוסיפים 250 עד 500 מיקרוליטרים PBS T לצינורות בהתאם לגודל הכדור, ומניחים אותם על המסובב או השייקר ב 200 סל"ד למשך שעה אחת בשתיים עד שמונה מעלות צלזיוס.

מוסיפים 200 מיקרוליטרים של תמיסת הנוגדנים המשנית ודוגרים את הצינורות בשתיים עד שמונה מעלות צלזיוס בחושך. למחרת, המשך להרכבת אנטרואידים אפיקליים מוכתמים על ידי סיבוב הצינורות והסרת 100 מיקרוליטרים של סופרנטנט. יש להשעות את התאים ב-100 המיקרוליטרים הנותרים של סופר-נאטנט ולהעביר את תרחיף התאים ל-500 צינורות מיקרוליטר.

צנטריפוגה את הצינורות בצנטריפוגה מיני למשך 20 שניות. הסר את supernatant ולתלות מחדש את הכדורים ב 100 microliters של טמפרטורת החדר כתם חומצת גרעין אדומה רחוקה. לאחר 20 דקות של דגירה, צנטריפוגה של התאים לתלות את הכדורים ב 100 microliters של PBS.

לאחר השטיפה השנייה צנטריפוגה להסיר 70 microliters של supernatant ו resuse את הכדורים בנפח הנותר של PBS. לאחר מכן העבירו את מתלה התא לכיסוי מסומן בגודל 24 על 60 מילימטר. החל 75 microliters של mountant ישירות על הדגימה ולהסיר את כל בועות עם קצה פיפטה.

לאחר ריפוי בן לילה בחושך, יש למרוח שכבה דקה של גליצרול על תלושי הכיסוי, ולאחר מכן להרכיב את מחליק הכיסוי על מגלשת הזכוכית וללחוץ אותה בעדינות למקומה. הקישו כדי להסיר בועות בין תלוש הכיסוי לשקופית. אפשרו לכיסוי להחליק בטמפרטורת החדר בחושך למשך שעתיים לפני שתדמיינו את האנטרואידים בהגדלה של פי 20 באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

עבור טיפולים אנטרואידיים, להקים אנטרוקוליטיס נמקית אפיקלית במודל צלחת במשך 24 שעות כפי שמתואר בכתב היד של הטקסט. לפני ביצוע הבדיקה, הסר 100 מיקרוליטרים של מדיה מכל באר והשאיר את 400 המיקרוליטרים הנותרים. הוסף 400 מיקרוליטרים של ריאגנט לבדיקת כדאיות התא לכל באר.

ערבבו במרץ את התוכן על שייקר צלחת במשך חמש דקות במהירות של 200 סל"ד כדי לגרום לתזה של התאים. לאחר מכן, להעביר 200 microliters לבאר אחת של צלחת תחתית ברורה היטב 96. חזור על 600 המיקרוליטרים הנותרים ויוצר ארבעה שכפולים טכניים לכל באר.

באמצעות קורא לוחות המסוגל להאיר, רשום ערכים באינטגרציה של 0.25 אלפיות השנייה והשווה את הערכים היחסיים בין הטיפולים. הכתם האימונופלואורסצנטי הייצוגי של הבקרה אישר את לוקליזציה אפיקלית של גרעינים כלפי לומן ואת זיהוי הנבל בקצה החיצוני של האפיתל. בהשוואה לבקרה, חשיפה לליפו פוליסכריד, נמק גידולי אלפא, או היפוקסיה בלבד לא גרמה לשינויים גלויים במורפולוגיית התא הגולמי E-cadherin או לוקליזציה של נבל או עוצמת פלואורסצנטית.

טיפול עם ליפו פוליסכריד או נמק גידולי אלפא בשילוב עם היפוקסיה שיבש את ארכיטקטורת האפיתל והדגים אובדן משמעותי של הצטלבות היצמדות וביטוי חלבון גבול המברשת שנחשף על ידי אובדן שמיעה ECA וכתם נבל. הכדאיות של התא האפיקלי נקבעה בתנאים נורמוקסיים או היפוקסיים. בתנאים נורמוקסיים בהשוואה לבקרת ליפו פוליסכריד או נמק גידולי אלפא לא השפיעו באופן משמעותי על כדאיות התאים של אנטרואידים.

עם זאת, ירידות משמעותיות בכדאיות נצפו בליפו פוליסכריד או נמק גידולי אלפא בשילוב עם היפוקסיה בהשוואה להיפוקסיה בלבד. תוך כדי ביסוס מודל אפיקלי החוצה בתוך המנה. זכור לשמור על EDTA בהשעיית התא קר כקרח.

זה ישפר את היפוך הקוטביות ויבטיח שכל ECM נוזלי כראוי והוסר. יישומים אחרים במורד הזרם כגון QPCR, RNA-seq, כתם מערבי או הערכות תפקודיות של חדירות מחסום יכולים להתבצע עוד יותר כדי לאפיין את התגובה לאיתות דלקתי בהיפוקסיה.