פלטפורמת וקטור Lentiviral יש יתרון גדול על פני פלטפורמת וקטור הפופולרי ביותר, במיוחד בגלל היכולת של וקטורים lentiviral להכיל הכנסה גנטית גדולה יותר. לכן, נראה כי וקטור lentiviral יהיה הפלטפורמה של בחירה ביישום כרוך באספקה של כלי CRISPR / Cas. טכניקה זו מחקה את המנגנון הרגולטורי הטבעי של ביטוי אלפא-סינוקליין אשר כאשר לקוי קשורים למחלות.
זה מאפשר כוונון עדין של רמת הביטוי לעומת שינויים חזקים בביטוי גנים. אני ממליץ בחום לאמת גישות אלה או דומות באמצעות RNAs מדריך מרובים להקרנה. יש שונות רבה בעוצמת RNA מדריך.
הדרך היחידה לקבוע את זה היא שיש סינון ואימות חזקים ומקיפים. ניתן להתאים בקלות את המערכת המפותחת למערכות מודל אחרות כגון מודלים של בעלי חיים, כולל מכרסמים ופרימטים לא אנושיים. ניסוי מעקב זה יכול לשמש כהוכחה לתפיסה למחקרים קליניים עתידיים.
הדגמת ההליך תהיה ד"ר יקטרינה איליצ'יץ', חברת צוות בכירה במעבדה שלי, המתמקדת בביצוע הליך שיבוט מולקולרי ליצירת פלסמידים וקטורים Lentiviral הקשורים לפרויקט זה. היא גם תדגים את הצעדים המרכזיים הכרוכים בייצור וקטור Lentiviral. כמו כן ידגים את ההליך ד"ר לידיה Tagliafierro, פוסטדוק מהמעבדה שלי התמקדות ההידור של תאי iPS אנושיים לתאים רלוונטיים פתולוגיים.
היא תדגים את הצעדים המרכזיים בהקמת מסיסים כדי להעריך את פרופילי המתילציה של סינוקליין intron1. אהילה סריקנדה, חברת צוות במעבדה שלי שמתמקדת בתרבות של תאי אב עצביים אנושיים שמקורם בתאי IPS. כדי להתחיל, לפתח את התחום הקטיטי DNMT3A מן d-Cas9-DNMT3A-GFP על ידי הגברת החלק DNMT3A של הווקטור.
לאחר עיכול שבר DNMT3A באמצעות אנזים הגבלת BamH1. להלביש אותו לתוך אתר BamH1 של וקטור PBK-301 שונה נושאת d-Cas9 ואומת על ידי רצף סנגר ישיר, כדי להחליף את הגן הכתב Meissen טהור ואת הפלסמיד וכתוצאה מכך עם תקציר GFP d-Cas9-DNMT3A-P2A טהור Meissen ופלסמיד עם FSC 1. מטהרים את שבר הווקטור בשיטת טיהור ג'ל.
הכן את ההוספה על ידי עיכול PBK-201 עם FSC-1. שכפל את קטע FSC 1 לווקטור כדי ליצור d-Cas9-DNMT3A-P2A-GFP. מעיל 15 ס"מ צלחות עם 0.2% ג'לטין עבור transfection ולחכות 10 דקות.
לאחר מכן שאפו את הג'לטין והוסיפו 22.5 מיליליטר של מדיום גלוקוז גבוה ו-2.5 מיליליטר של השעיית תאי HEK-293T בתרבות בעבר. הדגירה את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 עד להגיע 70 עד 80% confluence. כדי להכין את תערובת הפלסמיד מספיקה לצלחת של 115 ס"מ השתמש בארבעת הפלסמידים המתוארים בכתב היד.
הוסף 312.5 ליטרים של כלוריד סידן טוחן אחד לאותו צינור 15 מיליליטר עם פלסמיד ולהביא את הנפח הסופי ל 1.25 מיליליטר באמצעות מים מזוקקים כפול סטרילי. הוסיפו בעדינות 1.25 מיליליטר של שתי תתינות X BBM לצינור תוך כדי מערבולת. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
שאפו את המדיום מהתאים והוסיפו 22.5 מיליליטר של DMEM גלוקוז גבוה שהוכן טרי ללא סרום. מוסיפים 2.5 מיליליטר של תערובת transfection טיפה חכם לכל צלחת. מערבלים את הצלחות והדלגות ב-37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2 במשך שעתיים עד שלוש שעות לאחר הדגירה מוסיפים 2.5 מיליליטר סרום לצלחת כדי להשיג 10% דילול ודגירה לילה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2.
כדי לקצור את הנגיף לאסוף את supernatant מכל התאים מגולפים ולמשוך אותם 50 צינורות חרוט מיליליטר. צנטריפוגה ב 400 כדי 450 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן לסנן את supernatant דרך יחידת מסנן ואקום מיקרומטר 0.45. הבא ליצור שיפוע סוכרוז על ידי הכנת צינורות צנטריפוגה אולטרה חרוטיים.
בזהירות להוסיף את supernatant מסונן לשיפוע על ידי הפצה שווה של supernatant ויראלי בין כל צינור צנטריפוגה אולטרה מילוי לפחות שלושה רבעים של כל צינור. צנטריפוגה הדגימות ב 70000 גרם במשך שעתיים ב 17 מעלות צלזיוס. לאסוף בעדינות 30%-60% שברי סוכרוז לתוך צינורות נקיים להוסיף קר 1X PBS עד 100 מיליליטר של נפח הכולל פיפס מספר פעמים לערבב.
בזהירות להוסיף ארבעה מיליליטר של 20% סוכרוז ב 1X PBS לכל צינור כדי לרביט את ההכנה הנגיפית להמשיך על ידי צינורות כ 20 עד 25 מיליליטר של הפתרון הנגיפי לכל צינור. בזהירות לאזן את הצינורות ולאחר מכן צנטריפוגה ב 70000 גרם במשך שעתיים ב 17 מעלות צלזיוס. בזהירות שאף את הנוזל הנותר כדי להסיר לחלוטין את כל הנוזל עוזב את הנגיף המכיל כדורי אשר בקושי גלויים כתמים שקופים קטנים.
לאחר ריקון העל טבעי להפוך את הצינורות על מגבות נייר כדי לאפשר את הנוזל הנותר לנקז. הוסף 70 מיקרו ליטר של PBS 1X לצינור הראשון ביסודיות פיפטה להשעות מחדש את גלולה. מעבירים את ההשעיה לצינור הבא וחוזרים עם צינורות והעברה עד שכל הכדורים מושעים מחדש.
מוסיפים 50 מיקרו ליטרים נוספים של PBS 1X לצינור הראשון ומערבבים לשטוף אותו. לאחר מכן להעביר את ההשעיה לצינור השני לשטוף ולהמשיך עם כביסה והעברה כמו קודם לכן, מניב כ 120 מיקרו ליטר של ההשעיה הסופית חלבי מעט. צנטריפוגה ב 10000 גרם במשך 60 שניות כדי לקבל השעיה ברורה להעביר את supernatant לצינור חדש ולעשות חמישה מיקרו ליטר aliquot ולאחסן אותם שלילי 80 מעלות צלזיוס מקום Cryov חיוג עם MD NPC לתוך בלוק חום 37 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות ולהעביר את התאים המופשרים לצינור חרוט 15 מיליליטר עם 10 מיליליטר של DMEM-F12 חם.
צנטריפוגה ב-300 גרם לחמש דקות. שאפו את העל-טבעי והשעו מחדש את התאים בשני מיליליטר של מדיום N2B2 מלא מחומם מראש. הוסף שני מיליליטר של N2B27 לתליית התא וצלחת שני מיליליטר של תאים בכל באר של BMM שהוכן בעבר שישה צלחת היטב.
דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 לילה. כאשר MD NPCs הם ב 70%confluence, להתגמש אותם על ידי הוספת שני מיקרו ליטרים של מדריך lentivirus RNA d-Cas9-DNMT3A וקטורים בעדינות לסובב את הצלחת. לאחר הדגירה של התאים באותם תנאים כמו קודם לכן במשך 16 שעות להחליף את N2B27 בינוני 48 שעות לאחר ההעתקה.
הוסף N2B27 עם חמישה מיקרוגרם למיליליטר של מייסן טהור כדי להשיג את קווי MD NPC יציבים, לגדל את התאים במשך שלושה שבועות N2B27 בתוספת Meissen טהור לאפיין את פרופיל מתילציה של SNCA אינטרון 1. ראשית לחלץ DNA מכל קו תא מתמר יציב באמצעות ערכת מיצוי DNA, לאחר מכן להשתמש 800 ננוגרם של DNA לבצע המרה bisulfide עם ערכה מסחרית זמינה ולאחר מכן DNA מומר bisulfide ל 20 ננוגרם לליטר מיקרו. לניתוח רצף pyro להכין את התערובת הראשית PCR בגרעין צינור חינם להעביר את צלחת התגובה לתרמו-cycler ולהתחיל את PCR.
דמיינו את האמפליקונים באמצעות שני מיקרו ליטרים של מוצר PCR עם 30 וכתמי ברומיד בעקבות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. עבור מסיאי רצף פירו השתמשו בתערובות של מתילציה ומתילציה על ידי DNAs מומרים סולפידים וריגנטים רצף פירו כמתואר בכתב היד. חשב את ערכי המתילציה עבור כל אתר CPG באמצעות תפוקות פיזיות של תוכנת רצף pyro של Lentivirus d-Cas9-DMMT3A-GFP וקטור GFP נאיבי שנוצר באמצעות פרוטוקול זה דומים.
הדבר מצביע על כך שהתועלת של עמוד השדרה הווקטורי הממוטב בשילוב עם תוצאות פרוטוקול הייצור הממוטבות בתשואות גבוהות יותר של וקטור CRISPR-dCas9 וקטורים של וקטור Lentivirus d-Cas9-DNMT3 GFP וקטור היה נמוך פי ארבעה מזה של וקטור GFP נאיבי מציע כי יעילות האריזה של CRISPR d-Cas9-RNA מופחת. שיעורי התמרה של וקטור PURO נאיבי היו גבוהים פי חמישה בהשוואה לווקטור d-Cas9-DNMT3A. תוצאות אלה אושרו עוד יותר באמצעות GFP נאיבי ו d-Cas9-DNMT3A-GFP.
הפרוטוקול מבוסס EB המתואר כאן מאפשר בידול של MD NPCs. hiPSCs הביעו סמן עוצמה הנאה אוקטובר4 בעוד NPC MD מבוטא הן נסטין ו FoxA2. שבעה מסיונות רצף פירו תוכננו ו אומתו לכימות מצב המתילציה ב- SNCA intron 1.
כל 7 הראיות אומתו והראו מתאם ליניארי, באמצעות הראיה מאומתת ניתן היה לקבוע את רמות המתילציה ב 23 CPGs ב SNCA intron 1 הדבר החשוב ביותר לזכור מאשר השתתפות בהליך זה הוא לעבוד עם תאים להראות צמיחה נכונה ובריאות כדי להבטיח עקביות על פני ניסויים. הייצור של וקטורים עדשים מודגש במצגת זו ניתן לאמץ בקלות לייצור של אינטגרלים נגד וירוסים לקוי זה גם ניתן לשנות בקלות כדי ליצור כמויות גדולות יותר או וקטורים מרוכזים יותר. טכניקה זו יכולה לסלול את הדרך לחקור את ההשפעה הפתוגנית של גנים דה ויסות על גיל הקשורים ולא הפרעות גרניות כולל מחלת אלצהיימר ודמנציות הקשורות.
היתרון של וקטורים עדשים לפתח כאן הוא שזה לא סכנה או לא וקטורים עדשים זיהומיות יש רק השפעה מינימלית על מחזור התא הם בטוחים ואמין פלטפורמת משלוח עבור יישומים ריפוי גנטי.
