Lentiviral vektör platformu en popüler vektör platformu üzerinde büyük bir avantaja sahip, özellikle lentiviral vektörlerin yeteneği nedeniyle daha büyük genetik eklemek karşılamak için. Böylece, bu lentiviral vektör uygulamada tercih edilen platform crispr / Cas araçlarının teslim dahil olacağını görünüyor. Bu teknik, alfa-sinüklein ekspresyonunun doğal düzenleyici mekanizmasını taklit eder.
Gen ekspresyonundaki sağlam değişikliklere karşı ifade düzeyinin ince ayarını sağlar. Ben kuvvetle tarama için birden fazla kılavuz RNA kullanarak bu veya benzeri yaklaşımlar doğrulama nızı öneririz. Kılavuz RNA potens büyük değişkenlik vardır.
Bunu belirlemenin tek yolu sağlam ve kapsamlı tarama ve doğrulamadır. Geliştirilen sistem, kemirgen ve insan olmayan primat gibi hayvan modelleri gibi diğer model sistemlerine kolayca adapte edilebilir. Bu takip deneyi gelecekteki klinik çalışmalar için bir kavram kanıtı olarak hizmet verebilir.
Prosedürü gösteren Dr.Ekaterina Ilich, benim laboratuvarda üst düzey bir personel, bu proje ile ilgili Lentiviral Vektör Plazmidler oluşturmak için moleküler klonlama prosedürü yürütme odaklanan olacaktır. O da Lentiviral Vektör üretiminde yer alan önemli adımları gösterecektir. Ayrıca prosedürü gösteren Dr.Lidia Tagliafierro, patolojik ilgili hücrelere insan iPS hücrelerinin farklılaşması odaklanan benim laboratuvar bir postdoc olacaktır.
Sinüklein intron1 metilasyon profillerini değerlendirmek için tahlillerin kurulmasına ilişkin önemli adımları gösterecektir. Ahila Sriskanda, laboratuvarımda insan iPS hücre kaynaklı nöral ata hücrelerinin kültürüne odaklanan bir personel. Başlamak için, vektörün DNMT3A kısmını yükselterek d-Cas9-DNMT3A-GFP'den DNMT3A katalitik etki alanını geliştirin.
Bir BamH1 restriksiyon enzimi kullanarak DNMT3A parçası sindirilmesinden sonra. D-Cas9 taşıyan modifiye PBK-301 vektörünün BamH1 bölgesine d-Cas9 taşıyın ve doğrudan Sanger dizilimi ile doğrulanır, saf Meissen muhabir geni ve ortaya çıkan plazmidi GFP sindirimi d-Cas9-DNMT3A-P2A saf Meissen ve FSC 1 ile plazmid ile değiştirin. Bir jel arıtma yöntemi kullanarak vektör parçasını arındırın.
FSC-1 ile PBK-201 sindirerek eklemek hazırlayın. D-Cas9-DNMT3A-P2A-GFP oluşturmak için FSC 1 parçasını vektöre klonla. Coat 15 santimetre plakalar transfection için% 0.2 jelatin ile ve 10 dakika bekleyin.
Sonra jelatin aspire ve yüksek glikoz orta 22.5 mililitre ve daha önce kültürlü HEK-293T hücre süspansiyon 2.5 mililitre ekleyin. Plakaları %5 CO2 ile 37 derecede kuluçkaya yatırın ve %70 ila %80'lik bir araya ulaşın. 115 santimetre lik plaka için yeterli olan plazmid karışımını hazırlamak için el yazmasında açıklanan dört plazmidi kullanın.
Plazmidler ile aynı 15 mililitrelik tüp e bir azı dişi kalsiyum klorür 312,5 mikro litre ekleyin ve steril çift distile su kullanarak 1,25 mililitre için son hacmi getirmek. yavaşça girdap sırasında tüp akıllıca iki X BBM çözeltisi 1,25 mililitre ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yat.
Hücrelerden orta aspire ve serum olmadan taze hazırlanmış yüksek glikoz DMEM 22,5 mililitre ekleyin. Her plakaya 2,5 mililitre transfeksiyon karışımı damla ekleyin. Kuluçkadan sonra 2-3 saat boyunca %5 CO2 ile 37 santigrat derecede plakaları döndürün ve %5 CO2 ile bir gecede 37 santigrat derecede %10 seyreltme ve kuluçkaya yatmak için plaka başına 2,5 mililitre serum ekleyin.
Virüs hasat için tüm transfected hücrelerden supernatant toplamak ve 50 mililitre konik tüpler onları çekin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 ila 450 g'da santrifüj edin ve supernatant'ı 0,45 mikrometre vakum filtre ünitesinden geçirin. Sonra konik ultra santrifüj tüpleri hazırlayarak bir sakaroz gradyan oluşturun.
Her ultra santrifüj tüpü arasında her tüpün en az dörtte üçünü doldurarak viral süpernatantı eşit olarak dağıtarak filtrelenmiş süpernatantı degradeye dikkatlice ekleyin. Numuneleri 70000 g'de 17 santigrat derecede iki saat santrifüj edin. Temiz tüplere %30 ila %60 sakaroz fraksiyonu toplayın, 100 mililitreye kadar toplam hacim ve pipeti birden fazla kez karıştırın.
Her tüp etüt etmek için her tüpe %20 sakarozun dört mililitresini dikkatlice ekleyin ve her tüp için yaklaşık 20 ila 25 mililitre viral çözeltiyi borulandırarak viral hazırlığı nitreye devam edin. Tüpleri dikkatlice dengeleyin ve sonra 70000 g'de 17 santigrat derecede iki saat boyunca santrifüj edin. Küçük yarı saydam noktalar olarak zar zor görülebilen peletleri içeren virüsü tamamen çıkarmak için kalan sıvıyı dikkatlice aspire edin.
Supernatant boşalttınktan sonra kalan sıvı drenaj sağlamak için kağıt havlu tüpler ters. Peleti yeniden askıya almak için ilk tüpe 70 mikro litre 1X PBS ve iyice pipet ekleyin. Süspansiyonu bir sonraki boruya aktarın ve tüm peletler yeniden askıya alınana kadar pipetleme ve aktarma ile tekrarlayın.
İlk tüpe 50 mikro litre 1X PBS ek leyip yıkayın. Daha sonra yıkamak ve yıkama ve daha önce olduğu gibi transfer devam etmek için ikinci tüp için süspansiyon aktarın, biraz sütlü son süspansiyon yaklaşık 120 mikro litre verimli. Centrifuge 10000 g için 60 saniye yeni bir tüp supernatant net bir süspansiyon transferi elde etmek ve beş mikro litre aliquot yapmak ve negatif 80 derece Santigrat onları saklamak MD NPC ile bir Cryovial yerleştirin 37 derece Santigrat ısı bloğu içine iki dakika ve sıcak DMEM-F12 10 mililitre ile 15 litrelik conical tüp için çözülmüş hücreleri aktarın.
Santrifüj 300 gr'da 5 dakika. Supernatant aspire ve önceden ısıtılmış tam N2B2 orta iki mililitre hücreleri yeniden askıya. Hücre süspansiyonuna iki mililitre N2B27 ekleyin ve daha önce hazırlanmış BMM kodlu altı kuyunun her kuyusundaki iki mililitre hücreyi plakalayın.
Hücreleri bir gecede %5 CO2 ile 37 derecede kuluçkaya yatırın. MD NPT'ler %70'lik bir leştiğinde, iki mikro litre lentivirus kılavuzu RNA d-Cas9-DNMT3A vektörleri ekleyerek ve plakayı yavaşça döndürerek aktarın. Hücreleri daha önce 16 saat aynı koşullarda kuluçkaya yattıktan sonra transdüksiyondan 48 saat sonra N2B27 ortamını değiştirin.
Kararlı MD NPC hatları elde etmek için saf Meissen mililitre başına beş mikrogram ile N2B27 ekleyin, SNCA intron 1 metilasyon profilini karakterize etmek için N2B27 artı saf Meissen üç hafta boyunca hücreleri büyümek. Önce dna çıkarma kiti kullanarak her kararlı transdüser hücre hattından DNA ayıklayın, sonra ticari olarak kullanılabilir bir kit ile bisülfit dönüşüm gerçekleştirmek için 800 nanogram DNA kullanın ve daha sonra bir bisülfit mikro litre başına 20 nanogram dna dönüştürülmüştür. Piro-sekme analizi için PCR ana karışımını çekirdeksiz bir tüpe hazırlayın reaksiyon plakasını bir termo-cycler'a aktarın ve PCR'yi çalıştırın.
Agarose jel elektroforezini takip eden 30 ve bromür boyama ile iki mikro litre PCR ürünü kullanarak amperleri görselleştirin. Piro-sekans lama tahlilleri için, el yazmasında açıklandığı gibi sülfür dönüştürülmüş DNA'lar ve piro-sıralama reaktifleri tarafından metillenmemiş ve metilasyonlu karışımlar kullanılmıştır. Lentivirus d-Cas9-DMMT3A-GFP vektörünün pyro-sektilasyon yazılımı fiziksel verimleri ve bu protokol kullanılarak oluşturulan Naive GFP vektörü kullanılarak her CPG sitesi için metilasyon değerlerini hesaplayın.
Bu, optimize edilmiş vektör omurgasının, optimize edilmiş üretim protokolü ile birlikte, Lentivirus d-Cas9-DNMT3 GFP vektörünün CRISPR-dCas9 vektörtransdüksiyon oranlarının daha sıkı olması yla birleştiğinde, CRISPR d-Cas9-RNA'nın ambalaj verimliliğinin azaldığını öne süren Naive GFP vektöründen dört kat daha düşük olduğunu göstermektedir. Naif PURO vektörünün transdüksiyon oranları d-Cas9-DNMT3A vektörüne göre beş kat daha yüksekti. Bu sonuçlar naif GFP ve d-Cas9-DNMT3A-GFP kullanılarak da doğrulandı.
Burada açıklanan EB tabanlı protokol MD NPC'lerin farklılaşmasına izin verir. Yedi piro-sekans lama tahlilleri SNCA intron 1'deki metilasyon durumunun ölçülmesi için tasarlanmış ve doğrulanmış.
Tüm 7 tahliller doğrulandı ve doğrusal korelasyon gösterdi, doğrulanmış tahliller kullanarak SNCA intron 23 CpGs de metilasyon düzeylerini belirlemek mümkün oldu 1 Bu prosedüre katılan daha hatırlanması gereken en önemli şey deneyler arasında tutarlılık sağlamak için uygun büyüme ve sağlık gösteren hücrelerle çalışmaktır. Bu sunumda vurgulanan mercimek vektörlerinin üretimi, daha büyük miktarlarda veya daha yoğun vektörler oluşturacak şekilde kolayca ölçeklendirilebilen, yetersiz anti-virüslerin integral üretimine kolayca kabul edilebilir. Bu teknik, genlerin yaşa bağlı de-regülasyon veya Alzheimer Hastalığı ve bunaklık dahil olmak üzere generatif bozukluklar üzerindeki patojenik etkisini keşfetmenin yolunu açabilir.
Mercimek vektörleri burada geliştirmek avantajı bu tehlike ya da bulaşıcı mercimek vektörleri değil sadece hücre döngüsü üzerinde en az etkiye sahip değil onlar gen tedavisi uygulamaları için güvenli ve güvenilir dağıtım platformu konum.
