A plataforma vetorial lentiviral tem uma grande vantagem sobre a plataforma vetorial mais popular, especificamente devido à capacidade dos vetores lentivirais de acomodar inserções genéticas maiores. Assim, parece que o vetor lentiviral seria a plataforma de escolha no aplicativo envolver a entrega de ferramentas CRISPR/Cas. Esta técnica imita o mecanismo regulatório natural da expressão alfa-sinucleína que quando prejudicada está associada à doença.
Permite ajuste fino do nível de expressão versus mudanças robustas na expressão genética. Recomendo fortemente a validação desta ou abordagens similares usando RNAs guia múltiplos para triagem. Há grande variabilidade na potência guia RNA.
A única maneira de determiná-lo é lá uma triagem e validação robustas e abrangentes. O sistema desenvolvido pode ser facilmente adaptado a outros sistemas de modelo, como modelos animais, incluindo roedores e primatas não humanos. Esses experimentos de acompanhamento podem servir como prova de conceito para futuros estudos clínicos.
Demonstrando o procedimento estará a Dra. Ela também demonstrará os principais passos envolvidos na produção do Vetor Lentiviral. Também demonstrando o procedimento será a Dra.
Ela demonstrará os principais passos no estabelecimento de ensaios para avaliar os perfis de metilação da sinucleína intron1. Ahila Sriskanda, uma funcionária do meu laboratório focada na cultura das células progenitoras neurais derivadas de células iPS humanas. Para começar, desenvolva o domínio catalítico DNMT3A a partir do d-Cas9-DNMT3A-GFP ampliando a porção DNMT3A do vetor.
Depois de digerir o fragmento DNMT3A usando uma enzima de restrição BamH1. Cloat-lo no local BamH1 do vetor PBK-301 modificado carregando d-Cas9 e verificado por sequenciamento Sanger direto, para substituir o gene puro meissen repórter e o plasmídeo resultante com GFP digest d-Cas9-DNMT3A-P2A puro Meissen e plasmid com FSC 1. Purifique o fragmento vetorial usando um método de purificação de gel.
Prepare a inserção digerindo PBK-201 com FSC-1. Clone o fragmento FSC 1 no vetor para criar d-Cas9-DNMT3A-P2A-GFP. Cubra placas de 15 centímetros com gelatina de 0,2% para a transfecção e espere 10 minutos.
Em seguida, aspire a gelatina e adicione 22,5 mililitros de médio glicose alto e 2,5 mililitros de suspensão celular HEK-293T previamente cultivada. Incubar as placas a 37 graus Celsius com 5% de CO2 até atingir 70 a 80% de confluência. Para preparar a mistura plasmida suficiente para placa de 115 centímetros use os quatro plasmídeos descritos no manuscrito.
Adicione 312,5 micro litros de um cloreto de cálcio molar ao mesmo tubo de 15 mililitros com os plasmídeos e leve o volume final a 1,25 mililitros usando água dupla estéril destilada. adicione suavemente 1,25 mililitros de duas soluções X BBM que caem rapidamente ao tubo enquanto o vórtice. Incubar por 30 minutos em temperatura ambiente.
Aspire o meio das células e adicione 22,5 mililitros de DMEM de alta glicose recém-preparada sem soro. Adicione 2,5 mililitros da mistura de transfecção para cada placa. Gire as placas e incubar a 37 graus Celsius com 5%CO2 por duas a três horas após a incubação adicione 2,5 mililitros de soro por placa para alcançar 10% de diluição e incubar durante a noite a 37 graus Celsius com 5%de CO2.
Para colher o vírus coletar o supernaente de todas as células transfeinadas e puxá-las em tubos cônicos de 50 mililitros. Centrifugar a 400 a 450 g por 10 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, filtrar o supernascer através de 0,45 unidade de filtro de vácuo de 0,45 micrômetro. Em seguida, crie um gradiente de sacarose preparando tubos cônicos de ultra centrifugação.
Adicione cuidadosamente o supernaente filtrado ao gradiente, distribuindo igualmente o supernatante viral entre cada tubo de ultra centrifugação preenchendo pelo menos três quartos de cada tubo. Centrifugar as amostras a 70000 g por duas horas a 17 graus Celsius. Colete suavemente frações de sacarose de 30% a 60% em tubos limpos adicione PBS frio de 1X até 100 mililitros de volume total e pipeta várias vezes para misturar.
Adicione cuidadosamente quatro mililitros de 20% de sacarose em 1X PBS a cada tubo para estratificar a preparação viral continuar tubondo aproximadamente 20 a 25 mililitros da solução viral por cada tubo. Equilibre cuidadosamente os tubos e, em seguida, centrífuga a 70000 g por duas horas a 17 graus Celsius. Aspire cuidadosamente o líquido restante para remover completamente todo o líquido deixando o vírus contendo pelotas que mal são visíveis como pequenos pontos translúcidos.
Depois de esvaziar o supernatante inverta os tubos em toalhas de papel para permitir que o líquido restante escorra. Adicione 70 micro litros de 1X PBS ao primeiro tubo e pipeta minuciosamente para suspender a pelota. Transfira a suspensão para o próximo tubo e repita com a tubulação e transferência até que todas as pelotas sejam restuadas.
Adicione mais 50 micro litros de 1X PBS ao primeiro tubo e misture para lavá-lo. Em seguida, transfira a suspensão para o segundo tubo para lavar e continuar com a lavagem e transferência como anteriormente, rendendo aproximadamente 120 micro litros da suspensão final ligeiramente leitosa. Centrífuga a 10000 g por 60 segundos para obter uma suspensão clara transferir o supernante para um novo tubo e fazer cinco alíquotas de micro litro e armazená-los a 80 graus Celsius negativos colocar um Cryovial com MD NPC em bloco de calor de 37 graus Celsius por dois minutos e transfira as células descongeladas para um tubo cônico de 15 mililitros com 10 mililitros de DMEM-F12 quente.
Centrífuga a 300 g por cinco minutos. Aspire o supernasce e suspenda as células em dois mililitros de meio N2B2 completo pré-aquecido. Adicione dois mililitros de N2B27 à suspensão da célula e placa dois mililitros de células em cada poço da placa de seis poços previamente preparada.
Incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de CO2 durante a noite. Quando os NPCs MD estiverem em 70% de confluência, transduzi-los adicionando dois micro litros de vetores RNA d-Cas9-DNMT3A e gire suavemente a placa. Depois de incubar as células nas mesmas condições anteriormente durante 16 horas substitua o n2B27 médio 48 horas após a transdução.
Adicione N2B27 com cinco microgramas por mililitro de Meissen puro para obter as linhas estáveis de MD NPC, cresça as células por três semanas em N2B27 mais meissen puro para caracterizar o perfil de metilação de SNCA intron 1. Primeiro extrair DNA de cada linha de células transdutoras estáveis usando um kit de extração de DNA, em seguida, usar 800 nanogramas de DNA para realizar uma conversão de bisulfeto com um kit comercialmente disponível e, em seguida, um bisulfeto converteu DNA em 20 nanogramas por micro litro. Para a análise de piro-sequenciamento, prepare a mistura mestre pcr em um tubo livre de núcleo transfira a placa de reação para um termociclador e inicie o PCR.
Visualize os amplicons utilizando dois micro litros de produto PCR com uma coloração de 30 e brometo após a eletroforese do gel agarose. Para ensaios de piro-sequenciamento usaram misturas de não-metilados e metilados por DNAs convertidos de sulfeto e reagentes piro-sequenciamento, conforme descrito no manuscrito. Calcule os valores de metilação para cada site cpg usando os rendimentos físicos do software piro-sequenciável do vetor Lentivírus d-Cas9-DMMT3A-GFP e o vetor ingênuo gerado pelo GFP usando este protocolo são comparáveis.
Isso sugere que a utilidade da espinha dorsal do vetorial otimizado combinada com o protocolo de produção otimizado resulta em altos rendimentos mais apertados das taxas de transdução de vetores CRISPR-dCas9 do vetor Lentivírus d-Cas9-DNMT3 GFP foi quatro vezes menor do que o vetor Gengitivo GFP sugerindo que a eficiência da embalagem do CRISPR d-Cas9-RNA seja reduzida. As taxas de transdução do vetor Puro Ingênuo foram cinco vezes maiores em comparação com o vetor d-Cas9-DNMT3A. Esses resultados foram confirmados ainda pelo uso do GFP ingênuo e d-Cas9-DNMT3A-GFP.
O protocolo baseado em EB descrito aqui permite a diferenciação de MD NPCs. hiPSCs expressaram marcador de potência de prazer Oct4 enquanto o MD NPC é expresso tanto Nestin quanto FoxA2. Sete ensaios de sequenciamento piro-sequenciamento foram projetados e validados para a quantificação do status de metilação no intron 1 SNCA.
Todos os 7 ensaios foram validados e mostraram correlação linear, utilizando os ensaios validados foi possível determinar os níveis de metilação nos 23 CPGs no SNCA intron 1 O mais importante a ser lembrado do que participar deste procedimento é trabalhar com células que mostram crescimento e saúde adequados para garantir consistência entre os experimentos. A produção de vetores de lentilha destacados nesta apresentação pode ser facilmente adotada para a produção de antivírus deficientes integrais que também pode ser facilmente dimensionada para gerar quantidades maiores ou vetores mais concentrados. Essa técnica pode abrir caminho para explorar o impacto patogênico da desregulação dos genes sobre a idade relacionada nem os transtornos generativos, incluindo a Doença de Alzheimer e demências relacionadas.
A vantagem dos vetores de lentilha se desenvolverem aqui é que não é perigo ou não vetores infecciosos de lentilha têm apenas efeito mínimo no ciclo celular eles são plataforma de entrega seguras e confiáveis para aplicações de terapia genética.
