Лентивирусная векторная платформа имеет большое преимущество перед самой популярной векторной платформой, в частности из-за способности лентивирусных векторов вместить более крупные генетические вставки. Таким образом, кажется, что лентивирусный вектор будет платформой выбора в приложении, связанной с поставкой инструментов CRISPR/Cas. Этот метод имитирует естественный регулирующий механизм экспрессии альфа-синуклеина, который при нарушении связан с болезнью.
Это позволяет тонкой настройки уровня экспрессии по сравнению с надежными изменениями в экспрессии генов. Я настоятельно рекомендую проверить этот или аналогичные подходы с использованием нескольких руководств RNAs для скрининга. Существует большая изменчивость в руководстве РНК потенции.
Единственный способ определить это есть надежный и всеобъемлющий скрининг и проверка. Разработанная система может быть легко адаптирована к другим модельным системам, таким как модели животных, включая грызунов и нечеловеческих приматов. Эти последующие эксперименты могут служить доказательством концепции будущих клинических исследований.
Демонстрация процедуры будет д-р Екатерина Ильич, старший сотрудник в моей лаборатории, упором на выполнение молекулярной процедуры клонирования для создания лентивирусных плазмидов вектор, связанных с этим проектом. Она также продемонстрирует ключевые шаги, связанные с производством Lentiviral Vector. Кроме того, демонстрируя процедуру будет Dr.Lidia Tagliafierro, postdoc из моей лаборатории упором на дифференциацию клеток iPS человека в патологических соответствующих клеток.
Она продемонстрирует ключевые шаги в создании анализов для оценки профилей метилирования синуклеина intron1. Ахила Срисканда, сотрудник моей лаборатории, сосредоточенная на культуре клеток человека, полученных из клеток iPS, нейронных клеток-предшественников. Для начала разработайте каталитический домен DNMT3A из d-Cas9-DNMT3A-GFP, усилив часть вектора DNMT3A.
После переваривания фрагмента DNMT3A с помощью фермента ограничения BamH1. Cloat его в BamH1 сайт модифицированного PBK-301 вектор проведения d-Cas9 и проверены прямым секвенирования Сэнгер, чтобы заменить чистый ген репортера Мейссен и в результате плазмид с GFP дайджест d-Cas9-DNMT3A-P2A чистый Мейссен и плазмид с FSC 1. Очистить фрагмент вектора методом очистки геля.
Подготовьте вставку, переварив ПБК-201 с FSC-1. Клонировать фрагмент FSC 1 в вектор для создания d-Cas9-DNMT3A-P2A-GFP. Пальто 15 сантиметров пластин с 0,2% желатина для трансфекции и ждать 10 минут.
Затем аспирировать желатин и добавить 22,5 миллилитров высокой глюкозы среды и 2,5 миллилитров ранее культурных HEK-293T клеточной подвески. Инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию с 5%CO2 до достижения 70 до 80% слияния. Для приготовления плазмидной смеси, достаточной для 115-сантиметровой пластины, используйте четыре плазмиды, описанные в рукописи.
Добавьте 312,5 микролитров одного хлорида молярного кальция в ту же 15 миллилитровую трубку с плазмидами и довнесите конечный объем до 1,25 миллилитров с использованием стерильной двойной дистиллированной воды. аккуратно добавьте 1,25 миллилитров двух X BBM раствор падение мудрым в трубку во время вихря. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре.
Аспирировать среду из клеток и добавить 22,5 миллилитров свежеприготовленной высокой глюкозы DMEM без сыворотки. Добавить 2,5 миллилитров трансфекции смеси падение мудрым к каждой пластине. Закружить пластины и инкубировать при 37 градусах по Цельсию с 5%CO2 в течение двух-трех часов после инкубации добавить 2,5 миллилитров сыворотки на тарелку для достижения 10%разбавления и инкубировать на ночь при 37 градусах по Цельсию с 5%CO2.
Для сбора вируса собирать супернатант из всех трансфицированных клеток и тянуть их в 50 миллилитров конических труб. Центрифуга при температуре от 400 до 450 г в течение 10 минут при комнатной температуре, а затем фильтровать супернатант через 0,45 микрометровый вакуумный фильтр. Далее создать градиент сахарозы, подготовив конические ультра центрифугации труб.
Аккуратно добавьте отфильтрованное супернатант к градиенту, в равной степени распределяя вирусный супернатант среди каждой ультра центрифугации трубки заполнения по крайней мере три четверти каждой трубки. Центрифуга образцов на 70000 г в течение двух часов при 17 градусах по Цельсию. Аккуратно соберите от 30%до 60% фракций сахарозы в чистые трубки добавить холодный 1X PBS до 100 миллилитров общего объема и пипетки несколько раз, чтобы смешать.
Аккуратно добавьте четыре миллилитров 20% сахарозы в 1X PBS к каждой трубке, чтобы стратифицировать вирусный препарат продолжается путем трубопроводов примерно от 20 до 25 миллилитров вирусного раствора на каждую трубку. Тщательно сбалансировать трубки, а затем центрифугу на 70000 г в течение двух часов при 17 градусах по Цельсию. Тщательно аспирировать оставшуюся жидкость, чтобы полностью удалить всю жидкость, оставляя вирус, содержащий гранулы, которые едва видны как небольшие полупрозрачные пятна.
После опорожнения супернатант инвертировать трубки на бумажных полотенцах, чтобы остаться жидкость для слива. Добавьте 70 микролитров 1X PBS в первую трубку и тщательно пипетку, чтобы повторно приостановить гранулы. Перенесите подвеску в следующую трубку и повторите с пипетки и передачи до тех пор, пока все гранулы повторно приостановлено.
Добавьте еще 50 микролитров 1X PBS в первую трубку и перемешайте, чтобы вымыть ее. Затем перенесите подвеску на вторую трубку для мытья и продолжить стирку и передачу, как и раньше, что дает около 120 микролитров слегка молочной окончательной подвески. Центрифуга на 10000 г в течение 60 секунд, чтобы получить четкую суспензию передачи супернатанта в новую трубку и сделать пять микролитров алицита и хранить их при отрицательных 80 градусов по Цельсию место Cryovial с MD NPC в 37 градусов по Цельсию тепловой блок в течение двух минут и передачи оттаящих клеток в 15 миллилитров конической трубки с 10 миллилитров теплого DMEM-F12.
Центрифуга при 300 г в течение пяти минут. Аспирировать супернатант и повторно приостановить клетки в двух миллилитров предварительно нагревается полный N2B2 среды. Добавьте два миллилитров N2B27 к клеточной подвеске и пластину два миллилитров клеток в каждом колодец ранее подготовленной BMM закодированной шести пластины хорошо.
Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию с 5%CO2 в одночасье. Когда MD NPCs находятся на 70% слияния, трансдуцатор их, добавив два микро-литра лентивирусного руководства РНК d-Cas9-DNMT3A векторов и осторожно вихрем пластины. После инкубации клетки в тех же условиях, что и ранее в течение 16 часов, заменяют N2B27 средней через 48 часов после трансдукции.
Добавить N2B27 с пятью микрограммами на миллилитр чистого Мейссена, чтобы получить стабильные линии MD NPC, выращивать клетки в течение трех недель в N2B27 плюс чистый Мейссен, чтобы охарактеризовать метилирование профиля SNCA intron 1. Сначала извлечь ДНК из каждой стабильной линии клетки трансдуцера с помощью набора для извлечения ДНК, затем использовать 800 нанограммов ДНК для выполнения преобразования бисульфида с коммерчески доступным комплектом, а затем бисульфид преобразуется ДНК до 20 нанограмм на микро-литр. Для пиро-секвенирования анализа подготовьйте мастер-микс ПЦР в ядре свободной трубки, перенесите реакционной пластины на термо-циклер и запустите ПЦР.
Визуализуйте ампликоны с использованием двух микролитров ПЦР-продукта с окрашиванием 30 и бромистого окрашивания после электрофорезы агарозового геля. Для пиро-секвенирования анализов использовались смеси не метилированных и метилированных сульфидными преобразуется ДНК и пиро-секвенирования реагентов, как описано в рукописи. Рассчитать значения метилирования для каждого сайта CPG с помощью пиро-секвенирования программного обеспечения физических урожаев Lentivirus d-Cas9-DMMT3A-GFP вектор и наивный вектор GFP порожденных с помощью этого протокола сопоставимы.
Это говорит о том, что полезность оптимизированной векторной магистрали в сочетании с оптимизированным протоколом производства приводит к более высоким урожаям более жестких векторов CRISPR-dCas9, трансдукционных показателей lentivirus d-Cas9-DNMT3 GFP вектор был в четыре раза ниже, чем у наивного вектора GFP, что свидетельствует о снижении эффективности упаковки CRISPR d-Cas9-RNA. Скорость трансдукции вектора Naive PURO была в пять раз выше по сравнению с вектором d-Cas9-DNMT3A. Эти результаты были дополнительно подтверждены с помощью Naive GFP и d-Cas9-DNMT3A-GFP.
EB на основе протокола, описанного здесь позволяет дифференциации MD NPCs. hiPSCs выразил удовольствие потенции маркер Oct4 в то время как MD NPC выражается как Nestin и FoxA2. Семь пиро-секвенирования анализов были разработаны и проверены для количественной оценки состояния метилирования в интроне SNCA 1.
Все 7 анализов были проверены и показали линейную корреляцию, используя проверенные анализы можно было определить уровни метилирования на 23 CPGs в SNCA intron 1 Самое главное помнить, чем посещать эту процедуру является работа с клетками, которые показывают надлежащий рост и здоровье, чтобы обеспечить согласованность между экспериментами. Производство векторов чечевицы, выделенных в этой презентации, может быть легко принято для производства интегральных дефицитных антивирусов, это также может быть легко масштабировано для генерации больших количеств или более концентрированных векторов. Этот метод может проложить путь для изучения патогенного воздействия генов де-регуляции на возрастных, ни генеративных расстройств, включая болезнь Альцгеймера и связанных с ними слабоумия.
Преимущество векторов чечевицы здесь заключается в том, что это не опасно или не инфекционные векторы чечевицы имеют лишь минимальное влияние на клеточный цикл, они являются безопасной и надежной платформой доставки для применения генной терапии.
