פרוטוקול זה מאפשר למשתמש לחקור את ההשפעה של הליכים כירורגיים פולשניים המשמשים במרפאה על התנהגויות תאים סרטניים, כגון הגירה, פלישה והתפשטות. שיטה זו מאפשרת באופן ייחודי הדמיה של אותו גידול לפני ואחרי הליך פולשני, ומספקת תובנה שניתן לפספס בגישה לא אורך. לאחר אישור חוסר תגובה לצביטת הבוהן בעכבר בוגר הרדמה, הרם את העכבר על מסגרת סטראוטקטית ואבטח את הראש עם מהדק אף ושני פסי אוזניים.
השתמשו במנורת חימום לשמירה על טמפרטורת הגוף, והחלת משחה על עיני החיה. באמצעות מספריים חדים, לגלח את הפרווה על הגולגולת מהעיניים לבסיס הגולגולת, ולהשתמש 70% אתנול כדי לעקר את העור החשוף. חותכים את העור בצורה מעגלית, ולהשתמש ספוגית כותנה כדי לגרד את periosteum חשוף.
לטפל באזור הניתוח עם ירידה של 1% לידוקאין, ו 1:100, 000 ריכוז של אפינפרין במשך חמש דקות לפני הסרת הפתרון עודף עם ספוגית כותנה. השתמש בדבק cyanoacrylate כדי לדבוק בשולי העור לגולגולת, ולמקם את המסגרת הסטריאוטקית תחת מיקרוסקופ סטריאו תפקוד עם הגדלה 4x. לאחר מכן, קדחו בזהירות קוטר שטחי של חמישה מילימטרים, חריץ עגול מעל עצם קודקודית ימנית.
ולהחיל טיפה של חיץ קליפת המוח על החריץ. השתמש במטחנים דקים כדי להרים את דש העצם כדי לדמיין את פני השטח של המוח, ולהשתמש מטלפסי נקודה מעוגלים, מחודדים, עדין מאוד כדי להסיר את מאטר דורה. במקרה של דימום, יש להשתמש בספוג ג'לטין נספג כדי להשיג דימום.
להזרקת תאים סרטניים, לטעון כשלושה microliters של התאים לתוך מזרק גז חמישה מיקרוליטר הדוק מצויד במחט סגנון נקודה שתי. תקן את המחט על זרוע המניפולטור הסטריאוטקסית, והסר את מאגר קליפת המוח מהרקמות החשופות. מניחים את קצה המזרק באמצע הגולגולת ומכניסים את המחט בעומק של 0.5 מילימטר מפני השטח של הגולגולת.
לאחר מכן, להוסיף טיפה של חיץ קליפת המוח craniotomy, ולהשתמש מזרק משאבת microsyringe כדי לספק את התאים בקצב של 250 עד 400 ננוליטר לדקה. כדי להכין את חלון הדמיה גולגולתית, להחליף את חיץ קליפת המוח עם טיפה של שמן סיליקון לאתר craniotomy, כדי למנוע בועות אוויר מתחת לחלון. לאטום את המוח החשוף עם כיסוי שישה מילימטר, ולהחיל דבק cyanoacrylate בין כיסוי הגולגולת.
לאחר מכן השתמש פינצטה עדין כדי ללחוץ בעדינות את כיסוי נגד הגולגולת. בנקודת הזמן הניסיונית המתאימה, מקם את העכבר עם הפנים כלפי מעלה בתיבת הדמיה, והגדר את מטרת המים 25x למיקום z הנמוך ביותר. מוסיפים טיפת מים גדולה למטרה, ומעבירים את תיבת ההדמיה לתא האקלים הכהה של המיקרוסקופ ב-37 מעלות צלזיוס.
הביאו את המטרה לחלון ההדמיה הגולגולתי עד שטיפת המים נוגעת בכיסוי. ובשימוש במצב epifluorescence, לבחון את הגידול דרך העין כדי להביא את התאים לפוקוס. כוונן את הלייזר לאורך הגל הנכון ובחר מצב חי.
לאחר בחירת מספר עמדות עניין להדמיה, רשום את הקואורדינטות שלהם בתוכנה. הגדר ערימת z עבור כל עמדה כדי לרכוש את הנפח המקסימלי של תאים סרטניים מבלי להתפשר על רזולוציית תא הגידול, עם גודל הצעד בין התמונות מוגדר לשלושה מיקרומטרים. לאחר מכן, לרכוש תמונות של נפח הגידול בעמדות שונות כל 20 דקות במשך שעתיים, הוספת מים למטרה לפני כל רכישת תמונה.
לאחר התמונה האחרונה נרכשת, להעביר את העכבר משטח חימום עם ניטור עד התאוששות מלאה. יום אחד לאחר סשן ההדמיה הראשון, אבטחו את העכבר הרדמה במסגרת הסטריאוטוקסית כפי שהוכח, ולהשתמש במטלית כותנה ספוגה באצטון כדי לנגב את קצות הכיסוי עד שהדבק מתרכך. החלק מחט 25 מד מתחת למכסה ולהשתמש מדפים נקודה דקה כדי להרים אותו, לחות את craniotomy עם חיץ קליפת המוח טרי.
לנקב את הגידול לעומק של מילימטר אחד עם מחט 25 מד, לעצור כל דימום עם ספוג ג'לטין סטרילי, ולאטום את פני השטח של המוח עם שמן סיליקון טרי. ואז להדביק כיסוי חדש של שישה מילימטרים על הפצע. לניתוח תמונה, פתחו את קובץ LIF לשגות בזמן בתוכנת המיקרוסקופ ובחרו בכרטיסיה 'תהליך', 'כלי תהליך' ו'מיזוג'.
בחרו בתמונה הראשונה של רצף הזמן ולחצו ראשונים. בחרו בתמונה השניה של רצף הזמן ולחצו על התמונה השניה. בתיבה מזג ממדים, בחר t עבור זמן ולאחר מכן לחץ על החל.
קובץ חדש עם שתי נקודות זמן ייווצר. לאחר מעקב אחר כל סידרת איבוד זמן במשך שלוש ערימות z רצופות בנפרד, גרור את התיקיה המכילה את התמונות לשגות בזמן ל- ImageJ. בחר את הכרטיסיה תוספים, מעקב ו- MtrackJ.
כדי לעקוב אחר כל תא בודד, בחר הוסף ולחץ על כל תא בכל נקודת זמן. לאחר מכן לחצו על 'מידה' ושמור את הקובץ כדי לחלץ את מידת הרצועות. הנדידה של תאים סרטניים בודדים יכולה להיקבע על ידי מעקב אחר נתיב הנדידה לאורך זמן במישורים xy שונים של מחסנית z ועלה כאחוז של תאים נודדים לפני ופוסט ביופסיה.
ניתן לכמת את שיעור התפשטות תאי הגידול בהתבסס על עיבוי Dendra2 מתויג H2B על מיטוזה ועלה כאחוז מהתאים המפרידים לפני הביופסיה שלאחריה. השוואת התפלגות מהירות הנדידה לפני ואחרי הביופסיה באותו גידול, מגלה כי מספר התאים הנודדים עולה לאחר ההתערבות, עם ירידה קשורה במספר התאים האיטיים ללא מהגרים. בממוצע לכל גידול, עלייה של פי 1.75 באחוז התאים הנודדים נצפית כאשר מבוצעת פגיעה דמוית ביופסיה, בהשוואה לעכברים שאינם בעלי שליטה.
למרות שאחוז תאי הגידול הנודדים יורד בסופו של דבר הן בעכברים בקרה והן בעכברים ביופסיים, עכברים ביופסיים עדיין מפגינים יכולת הגירה גבוהה יותר מאשר עכברי בקרה בסך הכל. התנהגות שגשוג תא הגידול גם מדגים עלייה של פי 1.52 במספר האירועים המיטוטיים על ביופסיה לאורך זמן, יחסית לעכברי בקרה שאינם עכברי בקרה. שימו לב, אין אינדוקציה של נדידת תאים סרטניים או התפשטות נצפתה לאחר החלפת חלון הדמיה גולגולתית ללא ביופסיה, המציין כי דחיפה התפשטות תאים סרטניים שיעורי ההגירה מופעלת במיוחד על ידי פגיעה דמוית ביופסיה.
חשוב לעבוד בדיוק גבוה ובמיומנות כירורגית במהלך שלבי ההדמיה, ההשתלה וההחלפה של הגולגולת. ייתכן שיהיה צורך בפועל נרחב.
