Este protocolo demonstra um novo procedimento para imunofluorescência sequencial e imunohistoquímica em criosecções de embroys de zebrafish em estágio inicial, o que permite análises precisas de co-localização em populações celulares específicas. A principal vantagem deste protocolo é a flexibilidade. Combina imunofluorescência e técnicas imunohistoquímicas usando uma única criosecção para maximizar a morfologia tecidual, co-localização da expressão e compatibilidade de anticorpos.
Este protocolo poderia ser aplicado a outros modelos de peixes ou anfíbios, pois esses pesquisadores frequentemente enfrentam complicações semelhantes com a disponibilidade de anticorpos e frequentemente realizam tipos semelhantes de experimentos. Trabalhar com crioseções embrionárias em estágio inicial pode ser complicado, pois são pequenas e a crioseção pode ser desafiadora, mas a preparação e a prática avançadas ajudarão a aliviar qualquer luta neste método. Existem vários passos em nosso protocolo que exigem tratamento e cuidado particulares e podem ser difíceis de dominar sem ver alguém demonstrar as técnicas.
Para começar, transfira os embriões de zebrafish quiméricos pós-fertilização anteriores e 48 horas de fertilização de um tubo com mistura de 15 25 OCT para um molde plástico usando fórceps minimizando qualquer transferência da mistura. Encha o molde aproximadamente metade com o meio OCT e misture delicadamente os embriões nele. Prepare moldes de plástico rotulados e transfira embriões desejados para os moldes plásticos rotulados vazios, minimizando a transferência do meio OCT.
Em seguida, encha suavemente com o meio OCT até o topo dos moldes com embriões. Trabalhando sob um microscópio estéreo leve para visualização, use agulhas para organizar embriões na orientação desejada. Em seguida, coloque os moldes preparados em um recipiente isolado com uma plataforma metálica e congele-os em gelo seco.
Coloque um balde de gelo suavemente sobre a plataforma metálica para criar uma câmara fria e congele por aproximadamente 30 minutos. Usando um conjunto criostat a menos 20 graus Celsius, corte os embriões incorporados em crioseções de 10 a 12 micrômetros de espessura enquanto verifica a profundidade da seção periodicamente em um microscópio para monitorar a localização e o tecido. Coloque as seções em lâminas de vidro carregadas e o ar seque-os à temperatura ambiente durante a noite.
Lave os slides três vezes durante cinco minutos em 1X PBS em um recipiente apropriado. Coloque os slides em uma superfície plana em uma câmara úmida. Use uma caneta de barreira para delinear as seções para manter o líquido nos slides.
Pipeta 200 microliters de tampão de bloco por seção e incubar em tampão de bloco por duas horas à temperatura ambiente. Prepare a diluição do anticorpo primário e bloqueie o tampão e misture bem por pipetação. Incline suavemente os slides para drenar o tampão do bloco e retornar à câmara úmida.
Pipeta 200 microliters de solução de anticorpos primários por seção nos slides e 200 microliters de tampão de bloco para as seções apropriadas como controle. Incubar os slides a quatro graus Celsius durante a noite em uma câmara úmida cheia de água deionizada certificando-se de selar as bordas da câmara para ajudar a reter a umidade. Lave os slides três vezes durante cinco minutos em 1X PBS e em um recipiente apropriado.
Prepare a diluição secundária do anticorpo durante a lavagem e bloqueie o tampão e misture bem por pipetação. Depois de colocar os slides em uma superfície plana em uma câmara úmida, adicione 200 microliters de solução de anticorpos secundários por seção. Incubar os slides em solução de anticorpos secundários à temperatura ambiente no escuro por 30 minutos.
Lave os slides três vezes durante cinco minutos em 1X PBS em um recipiente apropriado. Depois de colocar os slides em uma superfície plana, adicione a solução de coloração nuclear em cada seção e incubar coberto por 10 minutos. Depois de drenar a solução de coloração nuclear, monte os slides com mídia fluorescente de montagem fluorescente não endurecedora e um deslizamento de tampa de vidro.
Certificando-se de mantê-los no escuro a quatro graus Celsius até a imagem. Coloque os slides em recipientes individuais com 1X PBS e armazene plana a quatro graus Celsius durante a noite, enquanto agita suavemente para afrouxar os deslizamentos de cobertura o suficiente para que eles saiam quando agitados. Certifique-se de não pressionar o deslizamento da tampa ou tentar remover o deslizamento da tampa manualmente, mas espere até que eles saiam com o movimento mínimo forçado.
Depois que os deslizamentos de cobertura tiverem sido removidos, transfira suavemente os slides para um recipiente com PBS 1X fresco. Remova o PBS 1X e incuba os slides em soro fisiológico 1X com 0,1% de um surfactante não iônico três vezes por cinco minutos à temperatura ambiente. Incubar os slides em solução de peróxido de hidrogênio de 3% à temperatura ambiente por 15 minutos.
Em seguida, coloque o slide plano e adicione a queda do buffer de bloco sábia à superfície. Incline suavemente os slides para drenar o tampão do bloco. Seque a área ao redor das seções e coloque os slides em uma câmara úmida.
Adicione 200 microliters de solução de anticorpos primários por seção nos slides e incubar em câmara úmida a quatro graus Celsius durante a noite. Incline suavemente os slides para drenar a solução de anticorpos primários e lave duas vezes por cinco minutos em 1X TBST. Em seguida, aplique pronto para usar o fundo reduzindo a queda do reagente em cada seção e incubar em câmara úmida à temperatura ambiente por 20 minutos.
Incline suavemente os slides para drenar o tampão do bloco. Seque cuidadosamente a área ao redor das seções e coloque os slides em uma câmara úmida. Aplique uma solução de anticorpos secundárias para cada seção soltar sábio e incubar em câmara úmida à temperatura ambiente por 30 minutos.
Incline suavemente os slides para drenar a solução secundária de anticorpos e lave duas vezes por cinco minutos em 1X TBST. Depois de secar a área ao redor das seções, coloque os slides em uma superfície plana e adicione 200 microliters do substrato cromogênico HRP a cada seção. Inicie um temporizador quando o substrato tiver sido aplicado ao primeiro slide e incubar à temperatura ambiente por três minutos.
Drene a solução do substrato. Enxágüe os slides brevemente em um recipiente apropriado com 1X PBS e lave-os em água deionizada duas vezes por cinco minutos com agitação suave. Contratente os slides colocando-os na solução de coloração de hematoxilina por até 30 segundos e lave três vezes por cinco minutos cada em água desionizada.
Incubar os slides em um recipiente contendo a Água tapwater de Scott por um minuto e depois lavar novamente três vezes por cinco minutos em água deionizada. Desidratar os slides através de uma série de graus de etanol diluídos em água deionizada e xileno em uma capa química. Depois de remover os slides do xileno adicione imediatamente o meio de montagem à base de tolueno e coloque um deslizamento de cobertura.
Para garantir o sucesso durante o deslizamento da cobertura, é importante trabalhar de um lado do escorregador para o outro, enquanto baixa lentamente o deslizamento da tampa para evitar bolhas que obscureceriam o tecido. Finalmente, visualize e visualize os slides usando um microscópio de luz composto e câmera digital na ampliação de 100X. Anticorpos específicos usados aqui para detectar simultaneamente células proliferadoras e células doadoras identificaram e quantificaram células doadoras que estão se proliferando ativamente.
Após a imunofluorescência e a imunohistoquímica, é essencial gerar imagens de alta qualidade para identificar com precisão as células individuais. Um programa de análise de imagens foi usado para realizar sobreposição de imagens. Ao tentar este procedimento é mais importante para manchar adequadamente e combater lâminas de manchas durante a imunohistoquímica.
Após este procedimento, métodos adicionais podem ser realizados como modificações no protocolo original, como o uso de diferentes combinações de anticorpos, tipos de tecidos ou espécies. As imagens também podem ser analisadas de várias maneiras de obter dados relevantes. Essa técnica nos permitiu olhar para a co-localização e múltiplas origens genéticas como uma forma de investigar interações células para células e poderia ser aplicada de forma semelhante a outras técnicas que requerem análises detalhadas de co-localização.
Muitos dos reagentes na imunohistoquímica são perigosos e devem ser tratados em conformidade. O trabalho com etanol, xileno e montagem dura deve ser realizado no capô. Os resíduos da DAB devem ser descartados, pois os resíduos perigosos e as lavagens pós-DAB devem ser branqueadas.
