אינדוקציה של נגזרות somite של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה, או iPSC, הוא צעד קריטי לשימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים לטיפול רגנרטיבי או יישומי מחקר מחלות. טכניקה זו יכולה לשמש כדי להבדיל תאי iPS אנושיים לתוך נגזרות somite כגון מיוטום, דרמטום, sclerotome, ותאי סינדום בתנאים מוגדרים כימית. באמצעות iPSC הוקמה על ידי חולה הסובל מהפרעת שרירים שלד עקשן, שיטה זו יכולה לשמש עבור מידול פנוטיפ של המחלה לבדיקת טיפולים תרופתיים חדשים.
שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם כדי לקדם את ההבנה שלנו של הביולוגיה ואת המנגנונים שבבסיס ההתפתחות של mesoderm paraxial במהלך העובר האנושי. ארבעה ימים לפני תחילת אינדוקציה מזודירית טרום-מינית, מצפים מנה של 10 ס"מ עם ארבעה מיליליטר של תמיסת מטריצה חוץ-תאית עבור דגירה של לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, החלף את פתרון המטריצה החוץ-תאית בשמונה מיליליטר של מדיום תרבות תאים נטול מאכילים.
כדי להתחיל culturing ללא מאכיל, לשטוף את תרבות iPSC האנושית עם PBS, ולהוסיף מיליליטר אחד של פתרון CTK לצלחת התרבות. כאשר התאים מתחילים להתנתק מהתחתית של המנה, לשטוף את התרבות פעמיים עם PBS טרי כדי להסיר באופן מלא את כל התאים מאכיל SNL לפני הוספת מיליליטר אחד של מדיום תרבות תאים ללא מאכילים לצלחת. השתמש מגרד תאים כדי לנתק באופן ידני את תאי הגזע, ולהעביר את התאים לצינור חרוט 15 מיליליטר.
בעדינות pipette פתרון התא שלוש פעמים עם קצה פיפי 1,000 מיקרוליטר, ולהעביר את התאים לצלחת תרבות מצופה מטריצה חוץ תאית. לאחר מכן, להחזיר את התאים לאנקובטור תרבות התא במשך שלושה ימים. בסוף האינקובציה, החלף את מדיום תרבות התאים נטולת המאכילים בשמונה מיליליטר של מדיום אינדוקציה טרום-ימית של מסודרם, ויזום בידול מסודרם פרה-סמיטי בחמימת תרבות התאים במשך ארבעת הימים הבאים, וחליף את המדיום ביום השלישי.
בסוף הדגירה, לבודד את החלבון דמוי דלתא 1 תאים חיוביים על ידי ציטומטריה זרימה, ולאסוף את התאים ממוינים על ידי צנטריפוגה. תן את גלולה במיליליטר אחד של מדיום אינדוקציה mesoderm סומיטי לספירה, וזרע פעם אחת 10 לתאים החמישיים לתוך כל באר של צלחת מטריצה חוץ תאית מצופה 12 באר המכיל מיליליטר אחד של מדיום אינדוקציה mesoderm סומיטי בתוספת 10 micromolar של קינאז rho, או רוק, מעכב Y-27632. לאחר מכן, להחזיר את התאים לאנקובטור תרבות התא במשך ארבעה ימים נוספים, שינוי המדיום לא מכיל את המעכב בימים אחד ושלושה של תרבות.
עבור בידול סינדטום מתאי sclerotome, לשטוף את התאים sclerotome עם PBS לפני ניתוק התאים עם 0.2 מיליליטר של ניתוק התא reagent ל הבאר. לאחר שלוש דקות בטמפרטורת החדר, מוסיפים 0.8 מיליליטר של מדיום בסיס מוגדר כימית לכל באר, ומנתקים את התאים עם מגרד תאים. מעבירים את התאים לצינור חרוט 15 מיליליטר לצנטריפוגה, ולתלות מחדש את גלולה במיליליטר אחד של סינדום אינדוקציה בינוני אחד לספירה.
זרעים חמש פעמים 10 לתאים הרביעיים לתוך כל באר של צלחת מטריצה חוץ תאית מצופה 24 באר המכיל מיליליטר אחד של אינדוקציה סינדום בינוני אחד, ולהחזיר את הצלחת אינקובטור תרבות התא במשך שלושה ימים. ביום השלישי של אינדוקציה סינדום, להחליף את המדיום עם אינדוקציה סינדום בינוני שני, ולהחזיר את הצלחת לאנקובטור במשך 18 ימים, שינוי המדיום כל שלושה ימים. לאחר בידול מסודרם טרום-סמיטי, מעל 85% מהתאים חיוביים לחלבון דמוי דלתא 1, סמן של מסודרם טרום-סמיטי, אך שלילי עבור PAX3, סמן של מסודרם סומטי.
אוכלוסייה זו הופכת PAX3 חיובית תאים mesoderm לאחר ארבעה ימים של אינדוקציה mesoderm somitic. יתר על כן, כתמים של cadherin-11, סמן של mesoderm somitic epithelized, מצטבר רק בצמתים התא לתא, בעקבות התוספת של CHIR99021. ההתמדה כלפי דרמומיוטום, מיוטום, דרמטום, סקלרוטום וסינדטום יכולה להיות מוערכת על ידי אימונוציטוכימיה ו פלואורסצנטיות PAX3.
בדומה לפיברובלסטים עוריים אנושיים, תאי דרמטום שמקורם ב- iPSC מייצרים קולגן וחומצה היאלורונית כפי שהוערכו על ידי ELISA. כדי להדגים את תגובתיות דומה של סינדום אנושי שמקורו iPSC ו tenocytes מבוגרים אנושיים, גירוי מתיחה מכני ניתן לבצע. לפני מעבר IPSC, לאשר כי הקונפדרציה התרבותית היא בין 70 ל 80%ואת התאים המפוצלים ביחס של אחד עד שניים עד ארבעה בהתאם.
פסיעה זו היא קריטית עבור התברות iPSCs מוצלחת. עבור טיפולים עתידיים מבוססי תאים בשיטה זו, יש צורך להקים מצב חדש ללא חיידקים שאינו כולל רכיבים הנגזרים מבעלי חיים שאינם בני אדם.
