פרוטוקול זה מספק מסגרת לחקר שילוב חומצות שומן אקסוגניים ממקורות מארחים מורכבים לתוך קרום חיידקי, במיוחד סטפילוקוקוס אוראוס. הפרוטוקול משתמש בניתוח ליפידומי לא משוחד וחלקיקי ליפופרוטאין המבודדים מחלמוני ביצי עוף כמקור כלכלי לחומצות שומן מורכבות לכימות שילוב חומצות שומן בליפידים חיידקיים. טכניקות ספקטרומטריית המסה המתארות כאן מציעות פרספקטיבה שאין כמוה של פרופיל חומצות השומן של שומנים סטפילוקוקוס אוראוס, אך ניתן להתאים אותן לחקר ממברנות חיידקיות אחרות.
בעת ביצוע פרוטוקול זה, יש לדאוג לכך שכל שלב שבר יזהה וישמור על השבר המכיל LDL. הסרת אמוניה סולפט משבר הפלזמה היא קריטית עבור יישומים במורד הזרם של LDLs. לספק מקום בשפע צינורות ולשנות את המים לפי הצורך כדי לאפשר דיאליזה יעילה.
כדי להתחיל, לשטוף שני חלמונים פעמיים עם 30 מיליליטר של מלוחים סטריליים פוספט מאגר כדי להסיר אלבומין שיורית. לנקב את קרום vitelline עם קצה פיפטה סטרילית לנקז את התוכן של הממברנה לתוך צינור צנטריפוגה חרוט סטרילי 50 מיליליטר. מוסיפים כ-24 עד 30 מיליליטר או 17 תותב נתרן כלורי טוחן ב-pH 7 לחלמון הביצה ומערבבים במרץ.
ואז מניחים את הצינור על שייקר נדנדה לערבב בארבע מעלות צלזיוס במשך 60 דקות. צנטריפוגה דילול חלמון ביצה ב 10 מעלות צלזיוס ב 10, 000 פעמים גרם במשך 45 דקות. מעבירים את שבר הפלזמה העל-טבעי לצינור חרוט סטרילי של 50 מיליליטר, ומשאירים מאחור את השבר האפור.
וצנטריפוגה שוב. ראשית, מערבבים את שבר הפלזמה עם 40 נפח מסה אחוז אמוניום סולפט על שייקר נדנדה או מכשיר דומה בארבע מעלות צלזיוס במשך 60 דקות. לאחר התאמת ה- pH, צנטריפוגה שבר הפלזמה בארבע מעלות צלזיוס ו 10, 000 זמן g למשך 45 דקות.
הסר את השבר הצהוב semisolid העליון לתוך שבעה צינורות דיאליזה בגודל נקבובית קילודלטון. לספק מינימום של 25% של חדר נוסף בצנרת כדי לאפשר לו להתנפח. מניחים את צינורות הדיאליזה בשלושה ליטרים של מים אולטרה-חמים כדי להדייג בן לילה בשלוש מעלות צלזיוס כדי להסיר את אמוניום סולפט.
לאחר דיאליזה, צנטריפוגה הפתרון בארבע מעלות צלזיוס כפי שתואר קודם לכן. מוציאים בזהירות את השבר הצהוב העליון, החציסולי, לצינור סטרילי ומאחסנים בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה הלילית של התרבות, להעביר 500 microliters לשני בקבוקים סטריליים 250 מיליליטר מבולבל המכיל 49.5 מיליליטר של מרק טריפטון 1%.
דגירה במשך כארבע שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד להגיע לשלב אמצע ארוך. להעביר 100 מיליליטר של תרבות במרווחים של 25 מיליליטר לארבעה צינורות צנטריפוגה סטריליים 50 מיליליטר וצנטריפוגה ארבעת הצינורות ב 10, 000 פעמים גרם כדי גלולה את התאים. הסר את העל-טבעי והשהה מחדש כל גלולת תא ב-750 מיקרוליטרים של מרק טריפטון של 1%.
שלב את ארבעת מתלי התאים המיקרו-ליטריים של 750 לצינור יחיד של 15 מיליליטר. ואליקוט 350 מיקרוליטרים של ההשעיה התא לשש צינורות צנטריפוגה סטריליים 1.5 מיליליטר. השתמש פיפטה להוסיף 30 microliters של LDLs לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר כדי להשיג ריכוז סופי הרצוי של 5% דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד במשך ארבע שעות.
צנטריפוגה התרבויות בארבע מעלות צלזיוס ב 16, 000 פעמים גרם למשך שתי דקות. ולהשעות מחדש את כדורי התא ב330 microliters של מלוחים סטריליים פוספט-מאגר לשטוף. חזור על שטיפה זו עוד פעם אחת.
רשום את המשקל של ששת כדורי התא הרטוב על ידי חיסור המשקל של הצינור הריק. הצמד להקפיא את כדורי התא על קרח יבש. ראשית להוסיף כף מדידה אחת של 5 מילימטר תחמוצת זירקוניום חרוזי על גבי כל גלולת תא.
הוסיפו 740 מיקרוליטרים של מתנול בדרגת HPLC של 75% מקורר למינוס 80 מעלות צלזיוס ישירות לתוך כל צינור. לאחר מכן הוסיפו שני מיקרוליטרים של 50 מיקרומולרים דימיריסטויל פוספטידילכולין כסטנדרט פנימי. מניחים את המדגם המכיל 1.5 צינורות צנטריפוגה מיליליטר לתוך יציאה זמינה על homogenizer רקמת בלנדר כדור.
הומוגניזציה של הדגימות במהירות נמוכה. הגדרת שתיים עד שלוש במשך שלוש דקות. בדיקה חזותית של הדגימות להומוגניות.
אם גושי תאים גלויים, המשך הומוגניזציה בבלנדר התבליטים במרווחים של שתי דקות. לאחר מכן להוסיף 270 microliters של כלורופורם לכל מדגם במכסה המנוע אדים כימיים. מערבולת הדגימות במרץ במשך 30 דקות.
צנטריפוגה הדגימות בצנטריפוגה ספסל העליון עד 30 דקות לפחות של 2, 000 פעמים g. במכסה המנוע של האדים הכימיים, אוספים את העל-טבעי המונופאזי ומעבירים אותו למבחנה חדשה תוך הימנעות זהירה מכדור החלבון בתחתית צינור החילוץ. מעבירים את תמציות השומנים המדוללים שהוכנו בעבר לבקבוקון מדגם אוטומטי מתאים.
לצורך ניתוח מבוסס הזרמת זרימה, מקם את בקבוקוני הדגימה האוטומטית בדגימה אוטומטית מבוקרת טמפרטורה של מערכת HPLC המסוגלת יישומים של זרימה נימית. הגדר את מערכת HPLC בהתאם לכתב היד. Eluent הוא הציג מ קו העברת HPLC לספקטרומטר המסה דרך מקור יינון electrospray מצויד במחט מתכת 34 מד זרימה נמוכה.
בתוכנת בקרת המכשירים Thermo Tune Plus, הגדר את מתח היוון ל-4,000 וולט וגז נדן לחמישה. באופן דומה, הגדר את טמפרטורת נימי ל 150 מעלות צלזיוס ואת עדשת S ל 50%לחץ על כפתור הסריקה להגדיר, בתפריט מנתח, בחר FTMS. הגדר את שדה טווח המסה כנורמלי ובתחום הרזולוציה, בחר 100, 000.
ודא שסוג הסריקה מוגדר כמלא. תחת תפריט טווחי הסריקה, הזן 200 בשדה המסה הראשון והזן 2,000 בשדה המסה האחרון. לאחר הגדרה נוספת של דיוק המסה שנצפה, ממוצע האות על פני הפסגה הרחבה בכרומטוגרמת היונים הכוללת.
לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על סמל הגודל הממוזער בחלון התצוגה של ספקטרום המסה ובחר רשימת ספקטרום תצוגה. מאותו תפריט, בחר אפשרויות תצוגה ולאחר מכן כל התיבה הדו-מצבית 'פסגות' בתפריט התצוגה. לחץ על לחצן אישור כדי לסגור את חלון התצוגה.
לחץ שוב על סמל הגודל הממוזער בחלון התצוגה של ספקטרום המסה ובחר את המסה המדויקת של לוח הייצוא. הדבק את תא הנתונים המיוצא A1 של גליון העבודה הראשון בגיליון האלקטרוני החדש של Excel והמשך בהתאם לכתב היד. כדי לבצע זיהויי שומנים מדויקים על בסיס מסה, פתח את תוכנת LIMSA.
מהתפריט הראשי, בחר רשימת שיא תחת תפריט סוג ספקטרום. בחר מצב חיובי או מצב שלילי כדי להתאים לקוטביות שבה נרכשו נתוני ספקטרומטריית המסה. בשיא רוחב מלא בחצי מקסימום מעל חלון z, הזן את חלון החיפוש ההמוני הרצוי למציאת שיא.
בפרוטוקול זה, תוכן LDL של שבר הפלזמה הועשר עוד יותר על ידי משקעים של 30 עד 40 לוטין בטא קילודלטון. נוכחותם של רצועות חלבון ב 140, 80, 65, 60, ו 15 קילודלטונים בקורלציה עם האפופרוטאינים של LDLs. טיפול עם triclosan מעכב את הצמיחה של aureus staph במדיום ללא חומצות שומן.
בעוד שכשהם תרבויות עם פלזמה חלמון ביצה כמו מקורות חומצת שומן אקסוגניים מתגבר על עיכוב הצמיחה הנגרמת על ידי triclosan. באופן דומה, תוספי של תרבויות triclosan מטופלים עם LDL חלמון ביצה מועשר משחזר את הצמיחה. כמו כן, תוספת של LDLs חלמון ביצה תומך בצמיחה של חומצת שומן S.aureus מאופיין בעבר, auxotroph.
תוכן חומצות טרום שומן נמדד 1%טריפטון מרק או חלמון ביצה עוף LDL על ידי שימוש בהזרקת זרימה ספקטרומטריית מסה מדויקת ברזולוציה גבוהה. נמצאו כמויות מינימליות של חומצות שומן חופשיות. אורתוגונל חלקי פחות ריבועים ניתוח מפלה של שפע staph aureus קרום פוספוליפידים הפגינו הפרדה מעמדית ברורה, עם הרכב חומצת שומן של תנאים לא מטופלים חלמון ביצה עוף LDL מטופלים.
העשרת LDLs מחלמון ביצה עוף מספקת מקור זול של חומצות שומן מורכבות לחקירת האינטראקציות בין פתוגנים חיידקיים לליפופרוטאינים מארחים. כלורופורם ומתנול המשמשים להכנת תמציות השומנים מסוכנים. אנא הקפידו להשתמש בריג'נטים אלה במכסה המנוע של אדים כימיים ולהכיל את כל זרמי הפסולת.
