המטרה הכוללת של הליך זה היא לטהר ריבוזום ממיטוכונדריה של קווי תאים אנושיים בקנה מידה גדול שמספיק למחקרים מבניים. שיטת טיהור ריבוזום מיטוכונדריאלית זו מאפשרת אפיון של קומפלקסים מתרגמים, מוטנטים, הרכבות בקרת איכות ומתווכים של תת-אחדות mitoribosomal. אלה יכולים לשמש כדי לענות על שאלות מפתח על סינתזת חלבון במיטוכונדריה.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי cavitation חנקן משמש תותבת התא ורק 10 עד 10 תאים תרבות נדרשים להכין mitoribosomes לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה. טכניקה זו יכולה לגרום לגילוי של רכיבים חדשים של מכונות תרגום המיטוכונדריה והוא יכול לשמש עוד יותר לפיתוח של טיפולים חדשניים לטיפול בסרטן. לאחר culturing תאי HEK293S על פי פרוטוקול הטקסט, לקצור שני צינורות ליטר אחד של תאים על ידי צנטריפוגה ב 1, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך שבע דקות.
בזהירות decant supernatant במהירות resuspend כל גלולה ב 100 מיליליטר של PBS. לאחר מכן, בריכת התאים צנטריפוגה ההשעיה ב 1, 200 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן, לאחר decanting בזהירות על טבעי, לשקול את גלולה.
לאחר מכן, השתמש 120 מיליליטר של חיץ MIB כדי לעשות בו שימוש חוזר ולהשאיר את התאים המתווסכים להתנפח בחדר הקר במשך 20 דקות. מעבירים את התאים המנפחים לתא חנקן מקורר מראש על קרח. לאחר מכן, הוסף 45 מיליליטר של מאגר SM4 לתאים.
מהדקים את תא החנקן וממלאים אותו בחנקן עד שהלחץ מגיע ל-500 PSI. לאחר מכן, לסגור את הברזים ולשמור אותו על קרח במשך 20 דקות. שיטת תות התאים של חנקן מונעת לחץ פיזי חיצוני על התאים, מונעת נזקי חום לאברונים, וגז החנקן מגן על התאים מפני חמצון.
בנוסף, זוהי שיטה מאוד לשחזור. לאט לאט לשחרר את הלחץ בתא ולאסוף את lysate. לאחר מכן, כדי להסיר את פסולת התא ואת הגרעינים, צנטריפוגה החומר lysed ב 800 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
לאסוף את supernatant על ידי שפיכת אותו דרך חתיכה מקופלת של בד muslin לתוך מקור כל הזמן על קרח. אל תזרוק את גלולה. תן שימוש חוזר לכדור ב-90 מיליליטר של חיץ MiBSM.
לאחר מכן, באמצעות טפלון למטה homogenizer, הומוגניזציה המדגם ולחזור על הצנטריפוגה ב 800 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. שוב, לאסוף את supernatant על ידי לשפוך אותו דרך חתיכה מקופלת של בד muslin לתוך מקור כל הזמן על קרח. לאחר מכן, שלב את העל-טבעי הזה עם העל-טבעי הראשון.
צנטריפוגה המדגם ב 1, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאחר מכן, לאסוף את supernatant כמו קודם. לאחר השלכת גלולה, צנטריפוגה supernatant המכיל מיטוכונדריה גולמית ב 10, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
בזהירות לשטוף את כל גלולה רופפת מבלי להפריע את החלק ההדוק. לאחר מכן, השתמש ב- 10 מיליליטר של מאגר MiBSM כדי להשתמש שוב גלולה הדוקה. הוסף 200 יחידות של RNase חינם DNase לדגימה כדי להסיר את ה-DNA הגנומי ולסובב את הצינור על רולר בחדר הקר במשך 20 דקות כדי לעכל את המדגם באופן שווה.
צנטריפוגה המדגם ב 10, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות ולהשתמש שני מיליליטר של חיץ SEM כדי לנצל מחדש את גלולה. טען את כל ההשעיה המיטוכונדרית על גבי שיפוע סוכרוז. לאחר סיבוב השיפוע על פי פרוטוקול הטקסט, באמצעות פיפטה העברה, בזהירות לאסוף את הלהקה החומה נודדת בממשק של 32%ו 60% סוכרוז.
פרוטוקול זה משתמש בחנקן cavitation כדי לשבור את התאים. לאחר השליטה, בידוד בקנה מידה גדול של מיטוכונדריה טהורה מאוד, שלם יכול להיעשות בתוך תשע שעות והוא יכול בקלות להיות שונה ומותאם עבור סוגי תאים שונים קשקשים. לאחר הפשרת המיטוכונדריה הקפואה על הקרח, הוסיפו שני כרכים של חיץ תיזה לשלושה מיליליטר של מיטוכונדריה.
מיד לערבב על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. השתמש טפלון קטן למטה homogenizer כדי לסייע עם תמוגה דגירה הומוגנית על קרח במשך חמש עד 10 דקות כדי להשלים את התגובה. צנטריפוגה ליאזט ב 30, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך 20 דקות כדי להסיר את החומר מסיס.
לאחר מכן, בזהירות לאסוף את supernatant ולהשליך את גלולה. חזור על הצנטריפוגה כדי להבטיח הבהרה של העל-טבעי. לאחר מכן, בזהירות לאסוף את supernatant ולהשליך את גלולה.
עבור כל מיליליטר של חומר lysed, להכין כרית סוכרוז בצינור TLA-120.2 אולטרה ברור על ידי הוספת 0.4 מיליליטר של כרית סוכרוז לצינורות. שכבה כמיליליטר של מיטוכונדריה lysed על כל כרית סוכרוז וכתוצאה מכך יחס ליסנט לכרית של 2.5 לאחד. לאחר מכן, צנטריפוגה המדגם רוטור TLA-120.2 ב 231, 550 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך 45 דקות.
השליכו את העל-טבעי ולהשתמש ב-100 מיקרוליטרים של מאגר ההבשלה מחדש כדי לשטוף את הצינור ולהסיר שאריות סוכרוז. תן שוב את כדורי ולשלב אותם בסך הכל 100 microliters של חיץ ההתלות מחדש. בעוד resuspending גלולת כרית, זה חיוני כדי לבצע על הקרח, כדי למנוע חימום של המדגם וגם כדי למנוע קצף של המדגם על מנת להבטיח את השלמות המבנית של ריבוזום המיטוכונדריה.
Vortex המדגם על מהירות איטית במשך 30 שניות כדי להמיס את הצבירה הנותרת צנטריפוגה הצינורות ב 17, 949 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בזהירות לאסוף את supernatant ולחזור על הצנטריפוגה. לאחר מדידת ספיגת mitoribosome ב A260, לטעון את המדגם כולו על צינור שיפוע סוכרוז ליניארי יחיד.
צנטריפוגה המדגם ברוטור TLS-55 ב 213, 626 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך 120 דקות. כדי לשבר את המילוי ההדרגתי, לנקב את החלק התחתון של הצינור ולאסוף את מדגם טיפה חכם בצלחת 96 היטב. טיהור Mitoribosome לא צריך לקחת יותר משבע שעות עבור כמות מספקת של mitoribosomes.
כפי שהודגם במילוי הדרגתי זה של סוכרוז לא רציפה, המיטוכונדריה המטוהרת נודדת לרצועה התחתונה החומה בממשק של 32-60%. בעקבות ההפרדה של mitoribosomes ממתחמי מיטוכונדריה מסיסים על שיפוע סוכרוז, שתי אוכלוסיות mitoribosomal העיקריים מזוהים, מונוסום 55S ו subunit גדול 39S. נוכחותו של שבר תת-היחידות הגדול מרמזת על כך שתאים נקצרים במצב של חלוקה פעילה.
חלונית זו מציגה מיקרוגרף עם הדגימה מהשיא המונוניום 2 בהגדלה מכוילת של 1.23 אנגסטרום לפיקסל. מוצגים כאן נתונים לאחר עיבוד ראשוני החושפים מונוסמים שלמים. לבסוף, שחזור תלת מימדי מונוסום מאויר בפאנל זה.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך להכין mitoribosomes אנושי שלם למחקרים מבניים וביוכימיים. הפרוטוקול שלנו מציע הכנות סופיות באיכות גבוהה שניתן לשער למאקרומולקולות מיטוכונדריות אחרות.
