המבחן ddTRAP מספק את היכולת להשיג מדידה רגישה, חזקה, וכמותית מאוד של פעילות אנזימטית telomerase בתאים. היכולת לרוץ עד 96 דגימות לכל ריצה בצורה בתפוקה בינונית מציעה לנו יתרון גדול. אנחנו יכולים להפעיל את הפקדים והשכפולים לניתוח סטטיסטי נכון על הנתונים שנאספו.
מיד לפני lysing התא, להפשיר aliquot קפוא של מאגר תריס NP-40. לאחר הפשרה, מניחים את חיץ תיזה על קרח. הוסף מעכבי פרוטאז PMSF למאגר תות NP-40 כדי להגיע לריכוז סופי של 0.2 מילימולר.
לאחר מכן, להוסיף 40 microliters של מאגר תיזה לצינור המכיל גלולת תא כדי להגיע שקילות תא של 25, 000 תאים לכל microliter. בעדינות pipette את lysate למעלה ולמטה על מנת לשבור לפתוח את התאים. נסה להימנע מהכנת בועות.
אפשר לתאים lyse על קרח במשך 30 דקות. בעדינות מערבולת lysate כל 10 דקות כדי למנוע אשכולות של פסולת התא להיווצר. במהלך תמוגת התא, להכין תערובת אב בצינור microcentrifuge לתגובת הארכת telomerase, ולאחסן על קרח.
לאחר תות התא, פיפטה 48 מיקרוליטרים של מאסטר הארכה לערבב לתוך כל צינור PCR. הוסיפו שני מיקרוליטרים של ליט מדולל לכל צינור PCR כדי להגיע לשווי משקל תאי סופי של 50 תאים למיקרוליטר, והמשיכו את תגובת הארכת הטלומראז על פי כתב היד. הכינו תערובת אב בצינור מיקרוצנטריפוגה עבור ddTRAP, ולשמור אותו בטמפרטורת החדר.
פיפטה 19.8 מיקרוליטרים של ddPCR מאסטר לערבב לתוך כל צינור PCR. הוסף 2.2 microliters של פתרון תגובת ההרחבה הקודמת לכל צינור, משאיר נפח כולל של 22 microliters. כדי להגדיר את מחסנית ייצור טיפות, טען תחילה 20 מיקרוליטרים של הפתרון המוכן לתוך הדגימה האמצעית היטב במחסנית.
הקש בעדינות על צד המחסנית כדי להעביר את כל הבועות לראש הפתרון. כל בארות המחסנית חייבות להיות עמוסות בדגימה לפני טעינת שמן. לאחר מכן, לטעון 70 microliters של שמן ייצור טיפה לתוך באר השמן השמאלי.
אבטחו את אטם במקום על ידי חבלו אותו לקצוות המחסנית, והכנסו את המחסנית הטעונה וההרכבה לגנרטור טיפה. הגנרטור מראה אור ירוק מוצק כדי להודיע שהמחסנית ממוקמת כראוי. לאחר 60 עד 90 שניות, כאשר אור הגנרטור מפסיק להבהב, המחזור הושלם.
כעת הסר את המחסנית. מוציאים בעדינות את אטם הגז מהמחסנית. השתמש פיפטה רב ערוצית כדי pipette כ 40 microliters של טיפות שזה עתה נוצרו מן הגם הימנית לתוך צלחת PCR 96-well.
חום לאטום את הצלחת עם אטמי לוח PCR רדיד אלומיניום פעם כל הדגימות נטענים בצלחת 96 גם כדי למנוע אידוי. לאחר מכן, לטעון את הצלחת 96-well לתוך תרמוסיקלר כדי לבצע את תגובת PCR. כדי להתחיל, לטעון את הלוח 96 באר לתוך קורא טיפות.
כוון את הלוח כראוי כך שדגימה A1 תואמת לזה של המחזיק. פתח את התוכנה המשויכת לקורא טיפות. לחץ פעמיים על הבאר הראשונה, A01, כדי לפתוח את מסך עורך הבאר לדוגמה.
לחץ על ניסוי ובחר את סוג ההתן לשימוש מהתפריט הנפתח. בחר QX200 ddPCR EvaGreen Supermix כשיטה לזיהוי הנכון. לחץ על החל בצד הימני התחתון של מסך עורך הבאר כדי לשמור את ההגדרות המוגדרות על-ידי המשתמש בכל הבאר המסומן.
לאחר מכן, לחץ על יעד במסך עורך הבאר ולחץ על התפריט הנפתח Target כדי לבחור פקד לא ידוע, הפניה או פקד ללא תבנית כדי להגדיר את סוג הדגימה. במקטע שם לדוגמה, סמן את כל הדוגמאות בתווית ולחץ על החל. לחץ על הפעל כדי לקרוא את הלוח.
בחר עמודות או שורות במסך אפשרויות הפעלה כאשר תתבקש להודיע על הכיוון שבו יש לקרוא את הלוח. קבע את מספר ה טיפות מקובלות עבור כל מדגם על-ידי לחיצה כפולה על הבארים הבודדים או כותרות העמודות והעמודות כדי לספק רשימת מידע. עבור ddTRAP, דגימות עם 10, 000 טיפות מקובלות או יותר תקפות לניתוח נוסף.
סמן את בארות המייצגות שכפולים לדוגמה ודגימות NTC. הגדר ידנית את הסף עבור הדוגמאות על-ידי לחיצה על הסמל להגדרת ספי סף בפינה הימנית התחתונה של המסך. בפרוטוקול זה נמדדה פעילות טלומראז בלוח תאים המורכב מתשעה קווי תאים של סרטן ריאות ופיברובלסטים שליליים טלומראז.
סף נקבע בסביבות 2,000 משרעת פלואורסצנטיות עבור כל שלושת השכפולים הביולוגיים עבור SHP77, H2887 ו- NTC. טיפות חיוביות היו בעוצמת פלואורסצנטיות סביב 6, 000 משרעת פלואורסצנטיות, אשר יצרה אוכלוסייה ברורה בחלק העליון, ונפרד טיפות שליליות סביב 1, 100 משרעת פלואורסצנטיות. סך כל מוצרי הרחבת הטלומראז לתא המקביל בין כל הדגימות הוערך מהריכוז הנמדד של חומצות הגרעין, המייצג את פעילות הטלומראז בקווי סרטן הריאות.
כל זיהום RNase במהלך תמיסת או שלבי תגובת הארכה יהרוס את הפעילות האנזימטית telomerase שכן הוא קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין. ddTRAP ניתן לעקוב עם ddPCR ברמות ביטוי mRNA hTERT בתא. שתי ערכות הנתונים מאפשרות לנו לתאם את הביטוי של hTERT עם פעילות telomerase ולחפור עמוק יותר לתוך מנגנונים רגולטוריים telomerase פוטנציאליים כגון שיפוח חלופי.
אנחנו יכולים לחקור מניפולציות לגורמי שיפוח ספציפיים וההשפעות שלהם על פעילות telomerase. נכון לעכשיו, אנו מעצבים אפנוני שיפודי אוליגונוקלאוטיד כסמים פוטנציאליים המכוונים לפעילות טלומראז.
