Il saggio ddTRAP fornisce la capacità di ottenere una misurazione sensibile, robusta e altamente quantitativa dell'attività enzimatica della telomeasi nelle cellule. La possibilità di eseguire fino a 96 campioni per corsa in modo medio-throughput ci offre un grande vantaggio. Possiamo eseguire i controlli e le repliche per una corretta analisi statistica sui dati raccolti.
Immediatamente prima della lysing cellulare, scongelare un'aliquota congelata di tampone di lysis NP-40. Una volta scongelato, posizionare il tampone di lysis sul ghiaccio. Aggiungere l'inibitore della proteasi PMSF al tampone di lysis NP-40 per raggiungere una concentrazione finale di 0,2 millimolare.
Quindi, aggiungere 40 microlitri del tampone di lisi al tubo contenente un pellet cellulare per raggiungere un'equivalenza cellulare di 25.000 celle per microlitro. Pipettare delicatamente il lysate su e giù per rompere le cellule. Cerca di evitare di fare bolle.
Lasciare che le cellule si leghino sul ghiaccio per 30 minuti. Vortice delicatamente il lysate ogni 10 minuti per evitare la formazione di gruppi di detriti cellulari. Durante lalisi cellulare, preparare un master mix in un tubo di microcentrifugo per la reazione di estensione della telomerasi e conservare sul ghiaccio.
Dopo la llisi cellulare, pipetta 48 microlitri di estensione master mix in ogni tubo PCR. Aggiungere due microlitri di lysate diluito a ciascun tubo PCR per raggiungere un'equivalenza cellulare finale di 50 celle per microlitro e continuare la reazione di estensione della telomerasi secondo il manoscritto. Preparare un mix master in un tubo di microcentrifugo per il ddTRAP e mantenerlo a temperatura ambiente.
Pipettare 19,8 microlitri di master mix ddPCR in ogni tubo PCR. Aggiungere 2,2 microlitri della precedente soluzione di reazione di estensione a ciascun tubo, lasciando un volume totale di 22 microlitri. Per impostare la cartuccia di generazione delle goccioline, caricare prima 20 microlitri della soluzione preparata nel campione centrale bene nella cartuccia.
Toccare delicatamente il lato della cartuccia per spostare eventuali bolle nella parte superiore della soluzione. Tutti i pozzi della cartuccia devono essere caricati con campione prima di caricare l'olio. Quindi, caricare 70 microlitri di olio di generazione di goccioline nel pozzo dell'olio sinistro.
Fissare la guarnizione in posizione posizionarla alle estremità della cartuccia e posizionare la cartuccia caricata e assemblata nel generatore di goccioline. Il generatore mostra una luce verde solida per informare che la cartuccia è posizionata correttamente. Dopo 60-90 secondi, quando la luce del generatore smette di lampeggiare, il ciclo è completo.
Ora rimuovi la cartuccia. Rimuovere delicatamente la guarnizione dalla cartuccia. Utilizzare una pipetta multicanale per pipettare circa 40 microlitri delle goccioline appena generate dal pozzo destro in una piastra PCR da 96 po '.
Sigillare termicamente la piastra con guarnizioni della piastra PCR in alluminio una volta caricati tutti i campioni nella piastra da 96 pozzi per evitare l'evaporazione. Quindi, caricare la piastra da 96 po 'in un termociclo per eseguire la reazione PCR. Per iniziare, caricare la piastra da 96 pozzi nel lettore di goccioline.
Orientare correttamente la piastra in modo che il campione A1 corrisponda a quello del supporto. Aprire il software associato al lettore di goccioline. Fare doppio clic sul primo pozzo, A01, per aprire la schermata dell'editor del pozzo di esempio.
Fate clic su Esperimento (Experiment) e selezionate il tipo di saggio da utilizzare dal menu a discesa. Selezionare QX200 ddPCR EvaGreen Supermix come metodo di rilevamento corretto. Fare clic su Applica nella parte inferiore destra della schermata dell'editor di pozzi per salvare le impostazioni definite dall'utente in tutti i pozzi evidenziati.
Fare quindi clic su Destinazione nella schermata dell'editor di pozzi e scegliere il menu a discesa Destinazione per selezionare un controllo sconosciuto, di riferimento o senza modello per definire il tipo di esempio. Nella sezione Nome di esempio etichettare tutti gli esempi e fare clic su Applica. Fare clic su Esegui per leggere la piastra.
Selezionare Colonne o Righe nella schermata Opzioni di esecuzione quando viene richiesto di informare sull'orientamento in cui deve essere letta la piastra. Determinare il numero di goccioline accettate per ogni campione facendo doppio clic sui singoli pozzi o sulle intestazioni di colonna e riga per fornire una tabella di informazioni. Per il ddTRAP, i campioni con 10.000 o più goccioline accettate sono validi per ulteriori analisi.
Evidenziare i pozzi che rappresentano le repliche di esempio e gli esempi NTC. Impostare manualmente la soglia per gli esempi facendo clic sull'icona per impostare le soglie in basso a sinistra dello schermo. In questo protocollo, l'attività delle telomerasi è stata misurata in un pannello cellulare costituito da nove linee cellulari di cancro ai polmoni e fibroblasti telomerasi-negativi.
Una soglia è stata fissata a circa 2.000 ampiezza di fluorescenza per tutte e tre le repliche biologiche per SHP77, H2887 e NTC. Le goccioline positive avevano un'intensità di fluorescenza intorno a 6.000 ampiezza di fluorescenza, che formava una popolazione chiara nella parte superiore e si separava dalle goccioline negative intorno a 1.100 ampiezza di fluorescenza. I prodotti di estensione totale della telomeasi per cellula equivalente tra tutti i campioni sono stati stimati sulla base della concentrazione misurata degli acidi nucleici, che rappresenta l'attività delle telomerasi nelle linee tumorali polmonari.
Qualsiasi contaminazione da RNasi durante le fasi di lisi o di reazione di estensione distruggerà l'attività enzimatica della telomeasi poiché è un complesso di ribonucleoproteina. ddTRAP può essere seguito con ddPCR sui livelli di espressione dell'mRNA hTERT nella cella. I due set di dati ci permettono di correlare l'espressione di hTERT con l'attività delle telomerasi e scavare più a fondo nei potenziali meccanismi normativi della telomerasi come lo splicing alternativo.
Possiamo esplorare le manipolazioni a specifici fattori di giunzione e i loro effetti sull'attività delle telomerasi. Attualmente, stiamo progettando modulatori di splicing oligonucleotidi come potenziali farmaci mirati all'attività della telomeasi.
