פרוטוקול זה מסביר ייצור של microbeads, אשר ישמש כדי לסייע בשליטה על קצב השחרור ואת כמות עמילואיד שהוא חלבון של עניין. המיקרוביאדים ישתקו תאים בביו-חומר מתאים ויגן עליהם מסביבתם, כמו גם יאפשר להם להחליף תוצרי לוואי וחומרים מזינים בסביבתם. אנקפסולציה של תאים באמצעות טכניקה זו מבטיחה שליטה הדוקה בגודל החיידק כמו גם במספר התא, ואנחנו עושים זאת על ידי התאמת פרמטרי ייצור שונים.
אז אנקפסולטוריה של התאים המתוארים בפרוטוקול זה תיתן לנו יותר שחרור כרוני של עמילואיד לשימוש הן במערכות במבחנה והן במערכות במבחנה, והרעיון יהיה שזה ייתן לנו הבנה טובה יותר של מנגנוני המחלה וגם יאפשר לנו לבדוק טיפולים חדשים. שיטה זו יכולה לשמש כדי לגבש מערכת מבוקרת וללמוד את שחרורו של כל biomolecules עבור סוגי תאים רבים, בין אם לבד או בשילוב. כדי להתחיל, להסיר בקבוק כמעט confluent מהחממה.
טפל בתאים עם 0.25%פתרון טריפסין-EDTA ודגירה ב 37 C במשך חמש עד 10 דקות כדי לנתק את התאים. לאחר הוספת אמצעי DMEM/F12, לאסוף את התאים לתוך צינור 50 מיליליטר. צנטריפוגה התאים ב 1000 סל"ד במשך חמש דקות.
הסר את supernatant מחדש להשעות את גלולה ב- HEPES אגירת מלוחים להכפיל את ריכוז התא הרצוי הסופי. בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר, לערבב את ההשעיה תא זה ביחס אחד לאחד עם 4% משקל ונפח alginate פתרון כדי להשיג השעיה סופית המכילה את הריכוז הרצוי של התא בתתבר 2%משקל נפח alginate. כדי להגדיר את פרמטרי האנאקפסולציה, הגדר את המהירות של מכונת אנקפסולטור למהירות ההבלטה המרבית ולאחר מכן הגדר את המתח ואת התדר.
כדי להמציא את המיקרוביאדים, במזרק 20 מיליליטר, לטעון חמישה מיליליטר של ההשעיה התא-אלגינט ולצרף מזרק אנקפסולטור. כדי להתחיל את encapsulator, להפעיל את הזרימה אשר ידחוף את ההשעיה תא אלגינט דרך המאכיל, וזרם של טיפות יובלט דרך הזרבובית. לאסוף את המיליליטר הראשון בסקולר הפסולת כדי למנוע את הזרם הלא אחיד הראשוני.
לאחר מכן המשיכו להריץ את ארבעת המיליליטרים הנותרים המאפשרים ל טיפות ליפול לאמבט ג'לציה סידן כלורי. במגע עם אמבט הג'לציה, האלגינט ב טיפות מיד חוצה קישורים עם יוני הסידן באמבט gelation, ויוצרים microbeads כדורי. לאחר דקה אחת, הסר את מקור הג'לציה מהפלטפורמה המגנטית ואפשר למיקרוביאדים לנוח במשך ארבע דקות נוספות ללא תסיסה כדי להשלים את הג'לציה שלהם בטמפרטורת החדר.
כדי לאחזר את המיקרוביאדים, השתמש תחילה בזוג פינצטה סטרילית כדי להסיר פסולת אלגינט גדולה או חפצים. לאחר חיתוך הקצה של פיפטה פלסטיק, להשתמש בו כדי להעביר את microbeads מאמבט gelation למסנן רשת 74 מיקרומטר מוחזק מעל פסולת. כדי להבטיח הצלחה, אנחנו תמיד חותכים את הקצה של פיפטה פלסטיק כדי למנוע נזק microbeads ואנחנו עושים את זה בכל פעם שאנחנו מעבירים חרוזים מכלי אחד לאחר אנקפסולציה.
היפוך מסנן רשת מעל צינור צנטריפוגה. פיפטה מדיום התרבות המתאים על זה לשטוף את חרוזים במורד הצינור ולאפשר להם לצייד במדיום זה במשך חמש דקות. לאחר מכן להעביר אותם בקבוקון מלא בעבר עם המדיום המתאים עבור דגירה וניסויים נוספים.
כדי להעריך את הכדאיות של התא לאחר אנקפסולציה ותרבות, להוסיף תערובת פירוק כדי לשבש בעדינות את microbeads ולשחרר את התאים אנקפסולציה. דגירה התאים באינקובטור תרבות התא בתוספת 5%פחמן דו חמצני ב 37 C במשך 10 דקות עם תסיסה עדינה. להעריך את הכדאיות התא של תאים אלה על ידי הכתמת אותם עם כחול trypan ושימוש בתא hemocytometer.
כדי להעריך את יציבות החיידקים, למדוד את הקוטר הממוצע עבור מדגם מכל אוכלוסיית חיידקים לאורך קורס זמן באמצעות מיקרוסקופ ותוסדת הדמיה. לאחר ההכנה, חיידקים אלגינטים אחידים וספירתיים נוצרו בהצלחה באמצעות פרוטוקול זה. לאחר יום אחד בתנאי תרבות תאים סטנדרטיים, 7PA2 תאים אנקפסולציה חולקו באופן שווה microbeads.
כאשר התפשטות תאים 7PA2 נבדק באמצעות מבחן MTS, לא היה הבדל משמעותי בין ההתנהגות של 7PA2 תאים גדל עם או בלי alginate על פני תקופה של שבעה ימים. מדיה מותנה ניתח מ 2D ו 3D תרבויות של תאים 7PA2 גילה עלייה מתמדת עמילואיד-בטא 1-42 רמות בשתי התרבויות. קצב השחרור של עמילואיד-בטא 1-42 ממיקרוביאדים, או תרבות תלת מימד, דומה בפרופיל לזה ששוחרר מתרבות הדו-מימד.
7PA2 תאים אנקפסולציה microbeads אלגינט יכול לשמש ביעילות לשחרור מתמשך של עמילואיד-בטא. חיידקים לחריטה במוח החולדה חייבים להיות קטנים מספיק כדי להיות מוטבעים מבלי ליצור פגיעה גדולה. השתלת חרוז בקנה מידה מילימטרי בתוך המוח למטרות vivo לא יעבוד, ואילו microbead מפוברק באמצעות פרוטוקול זה יש גודל מתאים להכנסה בתוך ההיפוקמפוס של החולדה.
כדי לוודא שיש לנו חלוקה אחידה של תאים במוצר הסופי, חשוב לערבב ביסודיות את התאים בהשעיית אלגינט התא, וזה מבטיח שחרור אחיד של עמילואיד מכל חיידק.
