이 프로토콜은 방출 속도와 관심의 단백질인 아밀로이드의 양을 제어하는 데 사용되는 마이크로비드의 제조를 설명합니다. 마이크로비드는 적절한 생체 재료로 세포를 고정시키고 주변 환경으로부터 세포를 보호하고 부산물과 영양분을 주변 환경과 교환할 수 있도록 합니다. 이 기술을 사용하여 세포를 캡슐화하면 세포 수뿐만 아니라 미생물 크기의 엄격한 제어를 보장하고 다양한 제조 매개 변수를 조정하여 이를 수행합니다.
따라서 이 프로토콜에 설명된 세포를 캡슐화하면 체외 및 생체 내 시스템에서 사용할 아밀로이드의 만성 방출을 더 많이 제공 할 것이며, 아이디어는 우리에게 질병의 메커니즘에 대한 더 나은 이해를 제공하고 새로운 치료법을 테스트 할 수 있게 할 것입니다. 이 방법은 통제된 시스템을 공식화하고 혼자든 조합하든 많은 세포 모형을 위한 어떤 생체 분자든지의 방출을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 시작하려면 인큐베이터에서 거의 컨물수 있는 플라스크를 제거합니다.
세포를 0.25%의 트립신-EDTA 용액으로 처리하고 세포를 분리하기 위해 5-10 분 동안 37 C에서 배양하십시오. DMEM/F12 배지를 추가한 후 세포를 50밀리리터 튜브로 수집합니다. 5 분 동안 1000 RPM에서 세포를 원심 분리합니다.
상체를 제거하고 HEPES 완충식식염수에 펠릿을 다시 일시 중단하여 최종 원하는 세포 농도를 두 배로 늘리십시오. 50 밀리리터 원심분리기 튜브에서, 이 세포 현탁액을 4%의 중량 및 부피 알자네이트 용액과 1 대 1 비율로 혼합하여 2%의 중량 및 부피 알기네이트 용액에서 원하는 세포 농도를 포함하는 최종 현탁액을 얻습니다. 캡슐화 매개 변수를 설정하려면 캡슐화기 기계의 속도를 최대 압출 속도로 설정한 다음 전압과 주파수를 설정합니다.
마이크로비드를 제조하려면 20 밀리리터 주사기로 셀-알기네이트 서스펜션의 5밀리리터를 적재하고 캡슐화기에 주사기를 부착합니다. 캡슐화기를 시작하려면 피더를 통해 세포-알자네이트 서스펜션을 밀어주는 흐름을 활성화하고, 방울의 흐름은 노즐을 통해 압출됩니다. 초기 비균일 스트림을 피하기 위해 폐기물 비커에서 첫 번째 밀리리터를 수집합니다.
그런 다음 나머지 4 밀리리터를 계속 실행하여 방울이 염화 칼슘 젤레이션 욕조에 빠질 수 있게 합니다. 젤레이션 목욕과 접촉하면 액적의 알기네이트는 겔화 욕조의 칼슘 이온과 즉시 교차하여 구형 마이크로비드를 형성합니다. 1 분 후, 자기 플랫폼에서 젤레이션 비커를 제거하고 마이크로 비드가 실온에서 자신의 겔화를 완료하기 위해 동요없이 추가 4 분 동안 휴식을 취할 수 있습니다.
마이크로비드를 검색하려면 먼저 멸균 핀셋 한 쌍을 사용하여 큰 알기네이트 파편이나 유물을 제거하십시오. 플라스틱 파이펫의 끝을 절단 한 후, 폐기물 비커 위에 개최 74 마이크로 미터 메쉬 필터에 젤레이션 욕조에서 마이크로 비드를 전송하는 데 사용합니다. 성공을 보장하기 위해, 우리는 항상 마이크로 비드를 손상시키지 않도록 플라스틱 파이펫의 끝을 잘라 우리는 캡슐화 후 다른 하나의 선박에서 구슬을 전송 할 때마다이 작업을 수행합니다.
원심분리기 튜브 위로 메쉬 필터를 반전시면 됩니다. 파이프는 튜브 아래로 구슬을 세척하고 5 분 동안 그 매체에서 평형 할 수 있도록 그 위에 적절한 배양 배지를 피펫. 그런 다음 이전에 인큐베이션 및 추가 실험을 위한 적절한 매체로 채워진 플라스크로 옮김합니다.
캡슐화 및 배양 후 세포 생존 가능성을 평가하려면 용해 믹스를 추가하여 미생물을 부드럽게 방해하고 캡슐화된 세포를 방출합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 세포를 37 C에서 5 %의 이산화탄소로 보충하여 10 분 동안 부드러운 동요로 세포를 배양하십시오. 트라이판 블루로 염색하고 혈종계 챔버를 사용하여 이러한 세포의 세포 생존 가능성을 추정합니다.
미생물의 안정성을 평가하기 위해 현미경 및 이미징 소프트웨어를 사용하여 시간 과정을 통해 각 미생물 집단의 샘플의 평균 직경을 측정합니다. 준비 후, 균일하고 구형 알기네이트 마이크로비드는 성공적으로이 프로토콜을 사용하여 생성되었다. 표준 세포 배양 조건에서 하루 후, 캡슐화된 7PA2 세포는 마이크로비드에 균등하게 분포되었다.
7PA2 세포 증식이 MTS 분석기를 사용하여 시험되었을 때, 7일 동안 알기네이트의 유무에 관계없이 7PA2 세포의 동작 사이에는 유의한 차이가 없었다. 7PA2 세포의 2D 및 3D 배양에서 분석된 조건부 배지는 두 배양모두에서 아밀로이드 베타 1-42 수준이 지속적으로 증가하는 것으로 나타났다. 마이크로비드 또는 3D 배양으로부터 아밀로이드 베타 1-42의 방출 속도는 2D 배양에서 방출되는 것과 프로파일에서 유사합니다.
알지네이트 마이크로비드에 캡슐화된 7PA2 세포는 아밀로이드 베타의 지속적인 방출을 위해 효과적으로 사용될 수 있다. 쥐 두뇌에 있는 이식을 위한 Microbeads는 큰 병변을 만들지 않고 포함될 만큼 작아야 합니다. 생체 내 생체 목적으로 뇌 내에 밀리미터 크기의 비드를 이식하는 것은 작동하지 않을 것이지만,이 프로토콜을 사용하여 제작된 미생물은 쥐의 해마 내에서 삽입하기에 적합한 크기를 가지고 있습니다.
최종 제품에 세포의 균등한 분포를 가지고 있는지 확인하기 위해 세포 알긴산 현탁액의 세포를 철저히 혼합하는 것이 중요하며, 이것은 각 미생물에서 아밀로이드의 균일한 방출을 보장합니다.
