Этот протокол объясняет изготовление микробусов, которые будут использоваться для контроля скорости выпуска и количество амилоидов, который является белок интереса. Микробусы будут обездвиживать клетки в подходящий биоматериал, и это укроет их от окружающей среды, а также позволяет им обмениваться побочными продуктами и питательными веществами с окружающей средой. Инкапсуляция клеток с помощью этого метода обеспечивает жесткий контроль размера микробусов, а также количества клеток, и мы делаем это, регулируя различные параметры изготовления.
Таким образом, инкапсуляция клеток, описанных в этом протоколе, даст нам больше хронического высвобождения амилоидов для использования как в пробирке, так и в системах in vivo, и идея будет в том, что это даст нам лучшее понимание механизмов заболевания, а также позволит нам протестировать новые методы лечения. Этот метод может быть использован для формулирования контролируемой системы и изучения выпуска любых биомолекул для многих типов клеток, будь то в одиночку или в сочетании. Для начала удалите из инкубатора почти стеченную колбу.
Лечить клетки с 0,25%трипсина-ЭДТА раствора и инкубировать при 37 C в течение пяти-десяти минут, чтобы отделить клетки. После добавления DMEM/F12 среды, собирать клетки в 50 миллилитров трубки. Центрифуга клетки при 1000 об/мин в течение пяти минут.
Удалите супернатант и повторно приостановите гранулы в буферированном солевом растворе HEPES, чтобы удвоить окончательную желаемую концентрацию клеток. В 50 миллилитровой центрифуге трубки, смешать эту подвеску клетки в соотношении один к одному с 4%вес и объем альгинат решение для получения окончательной подвески, содержащей желаемую концентрацию клеток в 2%веса и объема альгината раствора. Чтобы установить параметры инкапсуляции, установите скорость инкапсуляторной машины до максимальной скорости экструзии, а затем установите напряжение и частоту.
Для изготовления микробусов в шприце 20 миллилитров загрузите пять миллилитров клеточно-альгинатной подвески и прикрепите шприц к инкапсулятору. Чтобы начать инкапсулятор, активируйте поток, который будет толкать клеточно-альгинатную подвеску через кормушки, и поток капель будет выдавливаться через сопло. Соберите первый миллилитр в стакане отходов, чтобы избежать первоначального не однородного потока.
Затем продолжайте запускать оставшиеся четыре миллилитров, позволяя каплям попасть в ванну гелиции хлорида кальция. При контакте с гелеобразной баней альгинат в каплях мгновенно пересекается с ионами кальция в гелеобразной ванне, образуя сферические микробусы. Через минуту снимите гелеобразный стакан с магнитной платформы и дайте микробусу отдохнуть еще четыре минуты без агитации, чтобы завершить их гелеобразование при комнатной температуре.
Для извлечения микробусов сначала используйте пару стерильных пинцетов для удаления любых крупных альгинатных обломков или артефактов. После разрезания конца пластиковой пипетки, использовать его для передачи микробусов из гелеобразной ванны в 74 микрометровый фильтр сетки, удерживаемый над стаканом отходов. Чтобы обеспечить успех, мы всегда разрезаем конец пластиковой пипетки, чтобы избежать повреждения микробусов, и мы делаем это каждый раз, когда мы переаднося бисер из одного сосуда в другой после инкапсуляции.
Переверните сетчатый фильтр над центрифугой трубки. Pipette соответствующей среде культуры над ним, чтобы вымыть бисер вниз трубку и дать им равновесный в этой среде в течение пяти минут. Затем перенесите их в колбу, ранее заполненную соответствующей средой для инкубации и дальнейших экспериментов.
Чтобы оценить жизнеспособность клеток после инкапсуляции и культуры, добавьте растворение смеси, чтобы мягко нарушить микробусы и освободить инкапсулированные клетки. Инкубировать клетки в инкубаторе клеточной культуры, дополненном 5%-ным углекислым газом при 37 С в течение 10 минут с нежным возбуждением. Оцените жизнеспособность клеток этих клеток, окрашивая их трипан-синим цветом и используя гемоцитометровую камеру.
Для оценки стабильности микробусов, измерить средний диаметр для образца из каждой популяции микробусов в течение курса времени с помощью микроскопа и изображений программного обеспечения. После приготовления с помощью этого протокола были успешно сгенерированы однородные и сферические альгинатные микробусы. После одного дня в стандартных условиях культуры клеток, инкапсулированные 7PA2 клетки равномерно распределены в микробусах.
Когда 7PA2 пролиферации клеток был протестирован с помощью анализа МТС, не было существенной разницы между поведением 7PA2 клеток, выращенных с или без альгината в течение семи дней. Условные средства массовой информации, проанализированные из 2D и 3D культур 7PA2 клеток показали постоянное увеличение уровня амилоид-бета 1-42 в обеих культурах. Скорость высвобождения амилоид-бета 1-42 из микробусов, или 3D-культуры, аналогична по профилю, что и выпущенная из 2D-культуры.
7PA2 клетки инкапсулированы в альгинат микробусы могут быть эффективно использованы для устойчивого выпуска амилоид-бета. Microbeads для engraftment в мозге крысы должны быть малы достаточно для того чтобы быть врезано без создавать большое повреждение. Имплантация шарика миллиметрового масштаба в головном мозге для целей in vivo не будет работать, в то время как микробус, изготовленный с помощью этого протокола, имеет подходящий размер для вставки в гиппокампе крысы.
Чтобы убедиться, что у нас есть равномерное распределение клеток в конечном продукте, важно тщательно смешивать клетки в клеточной алгинатной суспензии, и это гарантирует равномерное высвобождение амилоида из каждой микробусы.
