Ce protocole explique la fabrication de microbilles, qui seront utilisées pour aider à contrôler le taux de libération et la quantité d’amyloïde qui est une protéine d’intérêt. Les microbilles immobilisent les cellules dans un biomatériau approprié et les abriteront de leur environnement, ainsi que leur permettant d’échanger des sous-produits et des nutriments avec leur environnement environnant. L’encapsulation des cellules à l’aide de cette technique assure un contrôle serré de la taille des microbilles ainsi que du nombre de cellules, et nous le faisons en ajustant divers paramètres de fabrication.
Ainsi, l’encapsulation des cellules décrites dans ce protocole nous donnera plus d’une libération chronique d’amyloïde à utiliser à la fois dans les systèmes in vitro et in vivo, et l’idée serait que cela nous donnerait une meilleure compréhension des mécanismes de la maladie et aussi nous permettre de tester de nouveaux traitements. Cette méthode peut être utilisée pour formuler un système contrôlé et étudier la libération de toutes les biomolécules pour de nombreux types de cellules, que ce soit seul ou en combinaison. Pour commencer, retirez un flacon presque confluent de l’incubateur.
Traiter les cellules avec la solution trypsine-EDTA à 0,25% et incuber à 37 C pendant cinq à 10 minutes pour détacher les cellules. Après avoir ajouté le milieu DMEM/F12, rassemblez les cellules dans un tube de 50 millilitres. Centrifuger les cellules à 1000 RPM pendant cinq minutes.
Retirer le supernatant et suspendre à nouveau la pastille dans la solution saline tamponnée HEPES pour doubler la concentration cellulaire finale désirée. Dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres, mélanger cette suspension cellulaire dans un rapport un à un avec 4% de poids et de volume solution alginate pour obtenir une suspension finale contenant la concentration de cellules désirée dans une solution alginate de 2% de poids et de volume. Pour définir les paramètres d’encapsulation, réglez la vitesse de la machine encapsulateur à la vitesse maximale d’extrusion, puis réglez la tension et la fréquence.
Pour fabriquer les microbilles, dans une seringue de 20 millilitres, chargez cinq millilitres de la suspension cellule-alginate et fixez une seringue à l’encapsulateur. Pour démarrer l’encapsulateur, activez le flux qui poussera la suspension cellule-alginate à travers la mangeoire, et un flux de gouttelettes sera extrudé à travers la buse. Recueillir le premier millilitre dans le bécher à déchets pour éviter le flux initial non uniforme.
Ensuite, continuez à faire fonctionner les quatre millilitres restants permettant aux gouttelettes de tomber dans le bain de gelation au chlorure de calcium. Au contact du bain de gelation, l’alginate dans les gouttelettes croise instantanément les liens avec les ions calcium dans le bain de gelation, formant des microbilles sphériques. Après une minute, retirer le bécher de gelation de la plate-forme magnétique et laisser reposer les microbilles pendant encore quatre minutes sans agitation pour compléter leur gelation à température ambiante.
Pour récupérer les microbilles, utilisez d’abord une paire de pinces stériles pour enlever les gros débris ou artefacts d’alginate. Après avoir coupé l’extrémité d’une pipette en plastique, utilisez-la pour transférer les microbilles du bain de gelation à un filtre à mailles de 74 micromètres maintenu au-dessus d’un bécher à déchets. Pour assurer le succès, nous coupons toujours l’extrémité d’une pipette en plastique pour éviter d’endommager les microbilles et nous le faisons chaque fois que nous transférons des perles d’un récipient à l’autre après l’encapsulation.
Inverser le filtre à mailles sur un tube de centrifugeuse. Pipette le milieu de culture approprié sur elle pour laver les perles dans le tube et leur permettre d’équilibrer dans ce milieu pendant cinq minutes. Ensuite, transférez-les dans un flacon précédemment rempli du milieu approprié pour l’incubation et d’autres expériences.
Pour évaluer la viabilité cellulaire après l’encapsulation et la culture, ajouter le mélange de dissolution pour perturber doucement les microbilles et libérer les cellules encapsulées. Incuber les cellules dans un incubateur de culture cellulaire complétée par 5% de dioxyde de carbone à 37 C pendant 10 minutes avec une agitation douce. Estimer la viabilité cellulaire de ces cellules en les souinant avec du bleu trypan et à l’aide d’une chambre d’hémocytomètre.
Pour évaluer la stabilité des microbilles, mesurez le diamètre moyen d’un échantillon de chaque population de microbilles au cours d’un cours de temps à l’aide d’un microscope et d’un logiciel d’imagerie. Après la préparation, des microbilles d’alginate uniformes et sphériques ont été générées avec succès en utilisant ce protocole. Après une journée dans des conditions standard de culture cellulaire, les cellules 7PA2 encapsulées ont été réparties uniformément dans les microbilles.
Quand la prolifération cellulaire de 7PA2 a été examinée utilisant un essai de MTS, il n’y avait aucune différence significative entre le comportement des cellules 7PA2 cultivées avec ou sans alginate sur une période de sept jours. Les médias conditionnés analysés des cultures 2D et 3D des cellules 7PA2 ont indiqué une augmentation constante des niveaux amyloïdes-bêta 1-42 dans les deux cultures. Le taux de libération de l’amyloïde bêta 1-42 des microbilles, ou culture 3D, est similaire en profil à celui libéré de la culture 2D.
Les cellules 7PA2 encapsulées dans les microbilles d’alginate peuvent être efficacement utilisées pour la libération soutenue de l’amyloïde-bêta. Les microbilles pour l’engraftment dans le cerveau de rat doivent être assez petites pour être incorporées sans créer une grande lésion. L’implantation d’une perle à l’échelle millimétrique dans le cerveau à des fins in vivo ne fonctionnerait pas, tandis qu’une microbille fabriquée à l’aide de ce protocole a une taille appropriée pour l’insertion dans l’hippocampe du rat.
Pour s’assurer que nous avons une distribution égale des cellules dans le produit final, il est important de bien mélanger les cellules dans la suspension alginate cellulaire, ce qui garantit la libération uniforme de l’amyloïde de chaque microbille.
