Diese Methode ermöglicht es uns, die chemotaktische Aktivität von Blutmonozyten bei lebenden Tieren zu quantifizieren und die Auswirkungen schlechter Diäten auf die Monozytenfunktion und ihre zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen. Monozyten-abgeleitete Makrophagen können isoliert und mit verschiedenen Ansätzen analysiert werden, einschließlich Einzelzell- und Omics-Techniken, die eine Momentaufnahme der Gesundheit der Blutmonozytenstelle in Mausmodellen liefern. Das heutige Verfahren wird von Dr.Young Joo Ahn, einem Assistenzprofessor in meinem Labor, und Dr. Luxi Wang, einem Postdoc in meinem Labor, durchgeführt.
Vor Beginn des Verfahrens die Zellkulturhaube mit Desinfektionsmittel reinigen und die wachstumsfaktorreduzierte, von Kellermembran abgeleitete Lösung auf Eis vollständig auftauen. Bestatten Sie einzelne sterile Ein-Milliliter-Spritzen mit 26-Meter-Nadeln aus und legen Sie die Nadeln auf Eis. Sobald die Lösung aufgetaut ist, wischen Sie die Oberseite der Kellermembran-abgeleiteten Lösungsflasche mit einem Alkoholtupfer ab, bevor Sie 500 Mikroliter Lösung mit oder ohne Chemo-Anziehen in jede Milliliterspritze laden.
Entfernen Sie dann alle Luftblasen aus der mit der Kellermembran abgeleiteten Lösungsspritze, um eine gleichmäßige Steckerbildung zu gewährleisten. Nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Zehenkneifen, langsam injizieren Sie langsam ein ganzes Volumen von Kellermembran-abgeleitete Lösung ohne MCP-1 mit etwa 100 Mikroliter pro Sekunde subkutan in die rechte Flanke der anästhesierten Maus hinzugefügt. Und die gesamten 500 Mikroliter Kellermembran-abgeleitete Lösung mit MCP-1 in die linke Flanke des Tieres ergänzt.
Halten Sie die Spritze 20 bis 30 Sekunden nach der Injektion an Ort und Stelle, um ein Auslaufen der Lösung zu verhindern und einen einzigen, glatten Gelstecker bilden zu lassen, bevor Sie die Maus auf ein Wärmepad mit Überwachung bis zur vollständigen Genesung legen. Drei Tage nach der Injektion, entfernen Sie die rückenförmigen Haare von einem Plug-injizierten Tier und verwenden Zangen, um die Haut um den unteren Brust- und oberen Lendenwirbel zu erfassen. Machen Sie einen zwei Millimeter langen Schnitt in die Haut und schneiden Sie entlang der Mittellinie der Rückseite der Maus von den Halswirbeln bis zu einem Zentimeter über dem Kabeljau Wirbelknoten.
Trennen Sie die Haut von der Muskelschicht und fixieren Sie die Haut auf einer Polystyrolschaumplattform. Als nächstes, unter einem Sezieren Mikroskop, sorgfältig greifen Sie die faserige Kapsel, die den Keller Membran-abgeleiteten Gel-Stecker enthält und verwenden feine Zange, um die faserige Kapsel zu entfernen. Verwenden Sie dann eine feine Schere, um den Stecker zu reinigen.
Dann den gereinigten, von der Kellermembran abgeleiteten Gelstecker in ein entsprechend beschriftetes und gewogenes 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr übertragen. Wiegen Sie das Rohr, um das Gewicht des aus der Kellermembran abgeleiteten Gelsteckers zu berechnen. Für die vergänliche Vergärung von Geplug-Vergändern aus der Kellermembran verwenden Sie eine saubere, feine Schere, um den von der Kellermembran abgeleiteten Gelstecker in jedem Mikrozentrifugenrohr zu zerkleinern und 800 Mikroliter Verdrängung in die Stecker zu geben.
Wirbel mit der maximalen Geschwindigkeit für 10 Sekunden, um die Stecker zu stören und die Mikrozentrifugenrohre bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden in einem Thermomischer bei 1400 Umdrehungen pro Minute zu platzieren, um die von Kellermembran abgeleiteten Gelstecker vollständig aufzulösen. Am Ende der Inkubation die Steckerfragmente zweimal durch Zentrifugieren absedimenten und die Pellets in 300 Mikroliter PBS wieder aufhängen. Übertragen Sie 50 Mikroliter jeder Zellsuspension in neue Mikrozentrifugenröhrchen und beschriften Sie die Zellen in den neuen Röhrchen mit 0,5 Mikroliter Calcin.
Zählen Sie nach einer 10-minütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator die Anzahl der lebenden grünen Fluoreszenz-positiven und toten nicht fluoreszierenden Zellen auf einem automatisierten Zellzähler. Für eine einzellige Western Blot-Analyse fügen Sie einen Milliliter verdünnter Einzelzellsuspension zu einem rehydrierten Einzelzell-Western-Blot-Chip im Boden einer 10-Zentimeter-Petrischale hinzu. Nach fünf bis 15 Minuten den Chip unter Hellfeldmikroskopie untersuchen.
Etwa 15 bis 20 % der Mikrobrunnen sollten von einer einzigen Zelle belegt werden und weniger als zwei Prozent der Brunnen sollten zwei oder mehr Zellen enthalten. Wenn der Chip richtig geladen wurde, kippen Sie die Schale um 45 Grad und waschen Sie den Chip dreimal mit Suspensionspuffer, um alle nicht gefangenen Zellen zu entfernen. Nach dem letzten Waschen vorsichtig und laden Sie den Chip in die Elektrophoresezelle eines einzigen Zell-Western-Instruments, gelseitig nach oben, und decken Sie den gesamten einzelligen Western Blot Chip mit Lyse-Laufpuffer ab.
Initiieren Sie die Zelllyse und führen Sie das Instrument gemäß den entsprechenden Experimentparametern aus. Am Ende des Laufs spülen Sie den Chip mit zwei 10-Minuten-Wäschen mit frischem Waschpuffer pro Waschgang bei Raumtemperatur ab. Nach der zweiten Wäsche 80 Mikroliter der primären Antikörperlösung von Interesse in die Antikörper-Prothesenkammer geben und die Spangelseite nach unten senken, so dass die Antikörperlösung über den Chip ableitet.
Nach zwei Stunden bei Raumtemperatur den Chip dreimal im Waschpuffer und einmal in Wasser auf einem Shaker waschen. Inkubieren Sie den Chip mit einem geeigneten Sekundärantikörper für eine Stunde bei Raumtemperatur vor Licht geschützt. Am Ende der Inkubation den Chip dreimal mit Waschpuffer waschen und den Chip auf einem Schiebespinner drehen, um den verbleibenden Waschpuffer zu entfernen.
Um den einzelnen Zelle Western Blot Chip zu entfernen, legen Sie ein 15 Milliliter Rohr Rack in einem 60 Grad Celsius Wasserbad mit dem Wasser nur einen Zentimeter über dem Rack. In einer Dunstabzugshaube 40 Milliliter Strippingpuffer und 320 Mikroliter Beta-Morcepta-Ethanol in einen Kanister geben. Legen Sie den Chip in eine 10 Zentimeter lange Petrischale in den Kanister und versiegeln Sie den Kanister mit Parafilm.
Dann legen Sie den Kanister in den Rohrträger im Wasserbad. Nach 90 Minuten den Chip vorsichtig in eine neue Petrischale geben und den Chip einmal mit Waschpuffer kurz waschen, bevor 15 Milliliter frischer Waschpuffer in die Petrischale für eine 15-minütige Wäsche auf dem Shaker gegeben werden. In diesem repräsentativen Experiment wurden die zellen, die in jeden Stecker rekrutiert wurden, bei einem, drei und fünf Tagen nach der Injektion gezählt.
Durch Subtrahieren der Zellzahl in den fahrzeugbelasteten Steckern von der Zellenzahl in den MCP-1-belasteten Steckern wurde dann die Anzahl der Zellen berechnet, die speziell als Reaktion auf den Chemo-Anziehen rekrutiert wurden. Eine beschleunigte MCP-1 spezifische Rekrutierung und Akkumulation von Zellen wurde während des Fünf-Tage-Zeitraums beobachtet, mit Raten von 31.000 Zellen pro Tag nach einem Tag der Injektion auf bis zu 136 000 Zellen pro Tag, fünf Tage nach der Injektion. Die Einzelzell-Western-Blot-Analyse wurde dann verwendet, um die verschiedenen Zelltypen zu identifizieren, die an die von der Kellermembran abgeleiteten Stecker rekrutiert wurden, entsprechend ihrer Expression spezifischer Immunzellmarker von Interesse.
Zum Beispiel war der Prozentsatz der Monozyten innerhalb der MCP-1 geladenen Kellermembran-abgeleiteten Gelstecker am ersten Tag niedrig und erreichte am dritten Tag ihren Höhepunkt, bevor er an Tag fünf wieder zurückging, während die Makrophagenzahlen während des gesamten Studienzeitraums stetig stiegen. Bei MCP-1-geladenen Steckern war der Anteil der Monozyten plus Makrophagen innerhalb der isolierten Zellpopulation am dritten Tag am höchsten, was darauf hindeutet, dass nach drei Tagen die überwiegende Mehrheit der von MCP-1-abhängigen Chemotaxis rekrutierten Zellen Monozyten und Makrophagen waren. Obwohl die Gesamtzahl der Monozyten plus Makrophagen an Tag fünf im Vergleich zum dritten Tag in der Regel höher ist, spiegelt die Zellzahl am dritten Tag das periphere Blut von Monozyten-Chemotaxis und Rekrutierung genauer wider, und daher wird Tag drei für Kellermembran-Direktsteckeranalysen empfohlen.
Die erfolgreiche Erfassung einzelner Zellen für die nachgelagerte Analyse hängt von der Genauigkeit der Injektion und der vollständigen Entfernung der Stecker ab. Durchflusszytometrie, einzelliges Western Blotting, Bulk- oder Einzelzell-RNA-Sequenzierung und andere Omics-Verfahren können verwendet werden, um die Charakteristika und Phänotypen der rekrutierten Monozyten- und Monozyten-abgeleiteten Makrophagen zu bewerten.
