Essa metodologia nos permite quantificar a atividade quimotactic do monócito sanguíneo em animais vivos e estudar o efeito de más dietas sobre a função monócito e seus mecanismos subjacentes. Macrófagos derivados de monócitos podem ser isolados e analisados usando várias abordagens, incluindo técnicas de célula única e omics que fornecem um instantâneo da saúde do local do monócito sanguíneo em modelos de camundongos. O procedimento de hoje será conduzido pelo Dr. Young Joo Ahn, professor assistente do meu laboratório, e pelo Dr. Luxi Wang, um pós-doutor no meu laboratório.
Antes de iniciar o procedimento, limpe a capa da cultura celular com desinfetante e descongele completamente a solução derivada da membrana do porão reduzida no gelo. Equipar seringas estéreis individuais de um mililitro com agulhas de calibre 26 e coloque as agulhas no gelo. Uma vez descongelado a solução, limpe a parte superior do frasco de solução derivada da membrana do porão com um cotonete de álcool antes de carregar 500 micro litros de solução complementada com ou sem quimio attractante em cada seringa mililitro.
Em seguida, remova quaisquer bolhas de ar da solução derivada da membrana do porão de seringa carregada para garantir uma formação uniforme de plugue. Depois de confirmar a falta de resposta ao aperto do dedo do pé, injete lentamente um volume inteiro de solução derivada da membrana do porão sem o MCP-1 adicionado a aproximadamente 100 micro litros por segundo subcutâneamente no flanco direito do mouse anestesiado. E todos os 500 micro litros de solução derivada da membrana do porão complementadas com MCP-1 no flanco esquerdo do animal.
Mantenha a seringa no lugar de 20 a 30 segundos após a injeção para evitar o vazamento da solução e para permitir que um único plugue de gel liso se forme antes de colocar o mouse em uma almofada de aquecimento com monitoramento até a recuperação completa. Três dias após a injeção, remova os cabelos dorsais de um animal injetado por plugue e use fórceps para agarrar a pele ao redor da vértebra torácica inferior e lombar superior. Faça uma incisão de dois milímetros de comprimento na pele e corte ao longo da linha média da parte de trás do rato a partir das vértebras cervicais até um centímetro acima da junção vertebral do coddle.
Separe a pele da camada muscular e fixe a pele em uma plataforma de espuma de poliestireno. Em seguida, sob um microscópio dissecando, segure cuidadosamente a cápsula fibrosa que contém o plugue de gel derivado da membrana do porão e use fórceps finos para remover a cápsula fibrosa. Em seguida, use uma tesoura fina para limpar o plugue.
Em seguida, transfira o plug de gel derivado da membrana do porão limpo em um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro. Reweigh o tubo para calcular o peso do plugue de gel derivado da membrana do porão. Para a digestão do plugue de gel derivado da membrana do porão, use uma tesoura fina limpa para picar o plug de gel derivado da membrana do porão em cada tubo de micro centrífuga e adicionar 800 micro litros de deslocamento aos plugues.
Vórtice na velocidade máxima por 10 segundos para interromper os plugues e colocar os tubos de micro centrífugas a 37 graus Celsius por duas horas em um mixer termo a 1400 rotações por minuto para dissolver completamente os plugues de gel derivados da membrana do porão. No final da incubação, sedimente os fragmentos do plugue por centrifugação duas vezes e resuspenja as pelotas em 300 microliters de PBS. Transfira 50 microliters de cada suspensão celular para novos tubos de micro centrífugas e rotule as células nos novos tubos com 0,5 microliters de calcina.
Após uma incubação de 10 minutos a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono, conte o número de fluorescentes verdes vivos positivos e não-fluorescentes mortos em um contador celular automatizado. Para uma única análise de manchas ocidentais, adicione um mililitro de suspensão celular única diluída a um chip de mancha ocidental de célula única rehidratado no fundo de uma placa de petri de 10 centímetros. Depois de cinco a 15 minutos, examine o chip sob microscopia de campo brilhante.
Aproximadamente 15 a 20% dos micro poços devem ser ocupados por uma única célula e menos de dois por cento dos poços devem conter duas ou mais células. Se o chip estiver devidamente carregado, incline o prato 45 graus e lave o chip três vezes com tampão de suspensão para remover quaisquer células não tampadas. Após a última lavagem, cuidadosamente e carregue o chip na célula de eletroforese de um único instrumento ocidental celular, gel-side para cima, e cubra todo o chip de mancha ocidental de célula única com tampão de lise em execução.
Inicie a lise celular e execute o instrumento de acordo com os parâmetros de experimento apropriados. No final da corrida, enxágue o chip com duas lavagens de 10 minutos com tampão de lavagem fresco por lavagem à temperatura ambiente. Após a segunda lavagem, adicione 80 microliters da solução primária de anticorpos de interesse à câmara de sondagem de anticorpos e baixe o chip do lado do gel para baixo para que a solução de anticorpos se espalhe pelo chip.
Depois de duas horas em temperatura ambiente, lave o chip três vezes no tampão de lavagem e uma vez na água em um shaker. Incubar o chip com um anticorpo secundário apropriado por uma hora à temperatura ambiente protegido da luz. No final da incubação, lave o chip três vezes com tampão de lavagem e gire o chip em um girador de slides para remover qualquer tampão de lavagem restante.
Para retirar o chip de mancha ocidental de uma única célula, coloque um rack de tubo de 15 mililitros em um banho de água de 60 graus Celsius com a água apenas um centímetro acima do rack. Em um capô de fumaça, adicione 40 mililitros de tampão de descascamento e 320 microlitros de etanol beta morcepta a um recipiente. Coloque o chip em uma placa de petri de 10 centímetros dentro do recipiente e sele o recipiente com Parafilm.
Em seguida, coloque o recipiente dentro do rack de tubo no banho de água. Após 90 minutos, transfira cuidadosamente o chip para uma nova placa de petri e lave brevemente o chip uma vez com tampão de lavagem antes de adicionar 15 mililitros de tampão de lavagem fresco à placa de petri para uma lavagem de 15 minutos no shaker. Neste experimento representativo, as células recrutadas em cada plugue foram contadas em um, três e cinco dias após a injeção.
Ao subtrair a contagem de células nos plugues carregados pelo veículo da contagem de células nos plugues carregados mcp-1, o número de células especificamente recrutadas em resposta ao atrativo de quimioterapia foi então calculado. Observou-se um recrutamento e acúmulo específico de células do MCP-1 acelerados durante o período de cinco dias, com taxas aumentando de 31.000 células por dia após um dia de injeção para até 136.000 células por dia, cinco dias após a injeção. A análise de manchas ocidentais de células únicas foi então usada para identificar os diferentes tipos de células recrutadas para os plugues derivados da membrana do porão, de acordo com sua expressão de marcadores de células imunes específicas de interesse.
Por exemplo, a porcentagem de monócitos dentro dos plugues de gel derivados de membrana do porão mcp-1 foi baixa no primeiro dia e atingiu o pico no terceiro dia antes de cair novamente no quinto dia, enquanto o número de macrófagos aumentou constantemente ao longo do período de estudo. Para os plugues carregados mcp-1, a porcentagem de monócitos mais macrófagos dentro da população celular isolada foi maior no terceiro dia, indicando que após três dias, a grande maioria das células recrutadas por quimifitos dependentes do PCM-1 eram monocitos e macrófagos. Embora o número total de monócitos mais macrófagos seja tipicamente maior no quinto dia em comparação com o terceiro dia, a contagem de células no terceiro dia reflete com mais precisão o sangue periférico de quimiotaxis monócitos e recrutamento, e, portanto, o terceiro dia é recomendado para análises de plugue direto de membrana do porão.
A aquisição bem sucedida de células únicas para análise a jusante depende da precisão da injeção e da remoção completa dos plugues. Citometria de fluxo, manchas ocidentais de célula única, sequenciamento de RNA em massa ou célula única e outros procedimentos de omics podem ser usados para avaliar a característica e fenótipos dos macrófagos recrutados derivados de monócitos e monocitos.
