תרבויות אורגנואיד העכבר דומות יותר בארגון התא vivo מאשר תרבויות תאים מסורתיות. בחקר הסרטן, אורגנואידים מודל הגידול המקורי טוב יותר מאשר קווי תאים 2D והוא יכול לשמש כדי לבדוק טיפולים פוטנציאליים בסרטן במבחנה לפתח טיפולים תרופתיים חדשים. עבור חילוץ גוש en של מערכת urogenital העכבר הגברי לתפוס את כרית השומן משני צדי שלפוחית השתן ולמשוך כלפי מעלה כדי לחשוף את האשך.
בזהירות לנתח כל אשך הרחק משאר האזור urogenital. הרם בעדינות את שלפוחית השתן כך שהאזור האורגניטל מוגבה יחד, וחושף את השופכה שמתחתיו. תוך החזקת שלפוחית השתן, לכוון את המספריים על החלק התחתון של הערמונית הגבית כדי להצביע על השופכה.
כל אזור urogenital ישוחרר חלל הבטן. לאחר הסרת מערכת urogenital, בלוטות הלימפה האגן ממוקם מיד מאחורי מערכת urogenital משני צדי עמוד השדרה ייחשפו. כדי להסיר את בלוטות הלימפה אוריינט מדפים ישר מתחת לרקמת הלימפה ולמשוך למעלה.
לאחר מכן, לתפוס את פי הטבעת עם ממטרות ישר לחתוך, מושך על פי הטבעת כדי לפענח את המעי הגס כולו ואת המעי הדק כדי לחפש נגעים גרורתיים בבלוטות הלימפה mesenteric. כאשר איליום כולו הוסר להמשיך למשוך על התריסום כדי לחשוף את הקיבה. חותכים את הוושט כדי להסיר לחלוטין את הבטן.
אם נצפו נגעים גרורתיים בבלוטות הלימפה, ניתוח זהיר של צמתים אלה הרחק מהמעי לאחסון ב- PBS. כאשר הבטן הוסרה, הטחול ניתן לקצור מהצד הגבי של הבטן לאחסון ב 4% paraformaldehyde. הסר את הכבד לאחסון ב- PBS.
הסר את הכליות משני צדי עמוד השדרה יחד עם כל בלוטות הלימפה הכלייתי המכיל נגעים גרורתיים. כדי לחשוף את חלל בית החזה בזהירות לחתוך את הסרעפת לאורך כלוב הצלעות. הלחץ השלילי המשתחרר בתוך חלל בית החזה יחשוף את הלב והריאות.
משוך על עצם החזה כדי לפתוח את חלל בית החזה עוד יותר. סרוק את הפנים הגחוניות של חלל בית החזה לאורך כלוב הצלעות עבור נגעים גרורתיים בבלוטות הלימפה בבית החזה לצורך ניתוח אם קיים. בעודם אוחזים בעצם החזה, חותכים את כלוב הצלעות הגחוני כדי לגשת ללב ולריאות ולעצור על הלב כדי לחתוך מתחת לריאות.
כדי להסיר באופן מלא את הלב והריאות בגוש לחתוך את כל כלי הדם לפני קנה הנשימה. בזהירות להעביר את הלב מבלי לפגוע ברקמת הריאה או נגעים גרורתיים ריאות לתוך מיכל של PBS. עבור ניתוח של הגידול הערמונית למקם את האזור urogenital תחת מיקרוסקופ ניתוח.
השתמש בזוג מטלפים ישרים וזוג מדפים מעוגלים כדי להפוך את האזור urogenital על פני הגב שלה. אתר את אזור הערמונית הפרוקסימלי שניתן לזהות על ידי הצבע הוורוד-אדום של השופכה. לתפוס את השופכה בחוזקה כדי לאפשר מניפולציה של רקמת urogenital עם מדפים מעוגלים.
אתר את הבסיס של וריכים מכונן כדי לאפשר הסרה זהירה שלהם. לאחר מכן השתמש בצד המעוקל של המדפים כדי להסיר את האגרטלים ואת כמה שיותר שומן ורקמות חיבור ככל האפשר. בעוד עדיין מחזיק בחוזקה את השופכה ואת אזור הערמונית proximal, להשתמש בזוג מספריים מחודדים עדין כדי להסיר את שלפוחית השתן מן השופכה.
מחזיק את אזור הערמונית proximal ושופכה בחוזקה עם מלקחיים ישר לתפוס את אזור הערמונית לפנים עם הצד המעוקל של המלקחיים כדי למשוך בחוזקה את הרקמה מן שלפוחית השתן ואת שאר הערמונית. מניחים את רקמת הערמונית לפני הדם ב- PBS ומאתרים את אזור הערמונית הגחוני. הסר את אזור הערמונית הגחוני באותו אופן.
אם ניתן להבדיל את האזור הצדדי מאזור הגב להסיר את אזור הערמונית הצדדי משני הצדדים. לאחר מכן הסירו את אזור הערמונית הגבית והצבו את אזור הערמונית הפרוקסימלי בפרפורמלדהיד 4%. לאחר הטחון, מניחים את חלקי הגידול לתוך צינור 15 מיליליטר של חיץ עיכול לעיכול של שעה וחצי עד שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס.
בסוף העיכול, מעים את הרקמה המתעכלת על ידי צנטריפוגה להשליך את supernatant. תעיף את הצינור כדי לשחרר את גלולת התא. תן מחדש את התאים במיליליטר אחד של טריפסין מחומם מראש בתוספת 10 מעכבי רוק Y-27632 מיקרומולרי במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
בסוף הדגירה triturate תרחיף הרקמה חמש פעמים עם קצה פיפטה P1000 סטנדרטי. מחזירים את הצינור לאמבט המים לתוספו חמש דקות דגירה וטריוטורציה. עבור ציפוי כיפת מטריצה לשטוף את התאים מתעכלים תשעה מיליליטר של מדיום קר, ולאחר מכן לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה.
תן שימוש חוזר בתאים במיליליטר אחד של מדיום טרי לספירה. ואחרי הספירה, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה שוב. לדלל את תאי הגידול בנפח המתאים של מטריצה.
בזהירות טיפה 200 microliters של פתרון תא מטריצה לתוך כל באר של 55 מעלות צלזיוס חימם צלחת שש באר. אפשר את הכיפות להתגבש בטמפרטורת החדר במשך שתי דקות לפני הנחת הצלחת במהופך באינקובטור 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. כאשר הכיפות התגבשו באופן מלא להוסיף שני מיליליטר של מדיום אורגנואיד הערמונית בתוספת אנדרוגן R1881 ומעכב רוק לכל באר.
תחזיר את הצלחת לאנקובטור של תרבות התאים. תמונות ניתוח פלואורסצנטיות חושפות חלבון פלואורסצנטי ירוק, או ביטוי GFP, על ידי גידולים מוצקים בערמונית, מה שמצביע על כך שתאי הגידול מבטאים את Cre. הכבד והריאות מאותה תערוכה של בעלי חיים גידולים גרורתיים המבטאים GFP המוכיחים כי גידולים אלה מקורם בגידול הערמונית העיקרי.
בלוטות הלימפה באגן מעכבר זה מבטא GFP ולא עגבניות, המציין כי גידול גרורתי זה עקף את בלוטות הלימפה ולא נשאר רקמה נורמלית. ביום אחד של אורגנואידים קטנים תרבות שנוצר גידול ערמונית מוצקה מתחילים להיווצר עם שני תאים עגבניות GFP-ביטוי נוכח בתרבות האורגנואיד הגידול. ביום השביעי ומעבר כאשר האורגנואידים גידול הערמונית נוצרו באופן מלא עם זאת, האורגנואידים מבטאים GFP, אבל לא עגבניות, מה שמרמז כי האורגנואידים מקורם בתאי גידול המבטאים Cre ולא מתאים אפיתל נורמליים.
ביום הראשון לתרבות האורגנואידים הקטנים הנוצרים מגידול ערמונית מלא בנוזלים, הן תאים מבטאי עגבניות והן תאים מבטאי GFP נמצאים בתרבות האורגנואידית. אורגנואידים מגידולי ערמונית מלאים בנוזלים מבטאים GFP או עגבניות ביום השביעי ומעבר לו, מה שמצביע על כך שהאיברנואידים נוצרו מתאים שאינם מבטאים את Cre. כדי להישאר בכיוון בעת קצירת רקמת הערמונית, להיות מודעים לשלפוחית השתן ותצורות השופכה בכל עת.
לאחר הדור שלהם האורגנואידים יכולים לשמש יישומי הדמיה, ניתוח ביולוגיה מולקולרית ומסכי סמים.
