マウスオルガノイド培養は、従来の細胞培養よりもインビボ細胞組織によく似ています。がん研究では、オルガノイドは2D細胞株よりも元の腫瘍をモデル化し、新しい薬物治療を開発するためにインビトロで潜在的な癌療法をテストするために使用することができます。男性マウス泌尿生殖器系のエンブロック抽出のために膀胱の両側の脂肪パッドをつかみ、睾丸を露出させるために上方に引っ張る。
各睾丸を尿生殖器領域の残りの部分から慎重に解剖する。膀胱を穏やかに持ち上げて、尿生殖器領域が一緒に上昇し、下の尿道を露出させる。膀胱を保持しながら、下側前立腺の下側に向けて尿道を切開する。
泌尿生殖器領域全体が腹腔から放出されます。泌尿生殖器系を除去した後、泌尿生殖器系のすぐ後ろおよび脊柱の両側に位置する骨盤リンパ節が露出する。リンパ節を取り除くために、リンパ組織の下でまっすぐな鉗子を配向し、引き上げる。
次に、直腸をまっすぐ鉗子でつかみ、直腸を引き上げて結腸全体を解明し、腸間膜リンパ節の転移性病変を探す。全体のイリウムが除去されたとき胃を露出させるために十二指腸を引っ張り続けます.食道を切って胃を完全に取り除きます。
リンパ節に転移性病変が認められた場合は、これらの節を腸から慎重に解剖してPBSに貯蔵する。胃が取り除かれたとき、脾臓は4%パラホルムアルデヒドで貯蔵するために腹部の後側から収穫することができる。PBSに保存するための肝臓を除去します。
転移性病変を含む腎リンパ節と一緒に脊椎の両側から腎臓を取り除きます。胸腔を露出させるために、慎重にリブケージに沿って横隔膜を切断します。胸腔内で放出される陰圧は、心臓と肺を露出させます。
胸骨を引き上げて胸部腔をさらに開きます。胸部の歯房に沿って胸腔の腹側面をスキャンし、胸部リンパ節の転移病変が存在する場合は解剖を行います。胸骨を保持しながら、心臓と肺にアクセスするために腹側肋骨ケージを切り取り、心臓を引き上げて肺の下を切り取る。
完全に心臓と肺を除去するためにブロックは、気管内の前血管のすべてを切断します.肺組織や肺転移病変を損傷することなく、PBSの容器に慎重に心臓を移す。前立腺腫瘍の解剖のために、尿生殖器領域を解剖顕微鏡下に置く。
一対のストレート鉗子と湾曲した鉗子を使用して、尿生殖領域を後部表面に反転させます。尿道のピンク赤色で識別できる前立腺近位領域を見つけます。尿道をしっかりとつかんで、曲面鉗子で尿生殖組織を操作できるようにします。
精嚢の基部を見つけて、慎重に取り除きます。次に、鉗子の湾曲した側を使用して、精管とできるだけ多くの脂肪と結合組織を取り除きます。尿道と近位前立腺領域をしっかりと保持しながら、尿道から膀胱を取り除くために細かい尖ったはさみを使用してください。
真っ直ぐな鉗子で近位前立腺領域と尿道をしっかりと保持し、前立腺前立領域を鉗子の湾曲した側で把握し、組織を膀胱および残りの前立腺からしっかりと引き離す。前立腺前立腺組織をPBSに入れ、腹側前立腺領域を見つけます。同じように腹側前立腺領域を除去する。
側側領域が側側領域と区別できる場合は、両側の前立腺領域の横方向を除去する。次に、後元の前立腺領域を取り除き、4%パラホルムアルデヒドに近位前立腺領域を配置します。みじん切り後、腫瘍片を15ミリリットルの消化バッファーに入れ、摂氏37度で1時間半から2時間の消化を行います。
消化の終わりに、遠心分離によって消化された組織を沈降させ、上清を捨てる。チューブをフリックして細胞ペレットを緩めます。摂氏37度で5分間、10マイクロモルY-27632 ROCK阻害剤を補充したプリ温めたトリプシンの1ミリリットルで細胞を再懸濁する。
インキュベーションの終わりに、標準的なP1000ピペットチップで組織スラリーを5回トリチュレートする。さらに5分間のインキュベーションとトリチュレーションのために、チューブを水浴に戻します。マトリックスドームメッキの場合は、消化した細胞を9ミリリットルの冷媒で洗浄し、遠心分離によって細胞を採取する。
カウントのための新鮮な媒体の1ミリリットルで細胞を再懸濁します。そして、カウントした後、再び遠心分離によって細胞を収集します。適切な量のマトリックスで腫瘍細胞を希釈します。
慎重に55°Cの各ウェルにマトリックスセル溶液の200マイクロリットルをドロップし、6ウェルプレートを温めました。ドームを室温で2分間固めてから、プレートを37°Cのインキュベーターで20分間逆さまにします。ドームが完全に固まった場合は、各ウェルにアンドロゲンR1881とROCK阻害剤を補った前立腺オルガノイド培地の2ミリリットルを追加します。
プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。蛍光解剖画像は、緑色蛍光タンパク質、またはGFP発現を、固形前立腺腫瘍によって明らかにし、腫瘍細胞がCreを発現することを示す。同じ動物の肝臓と肺は、これらの腫瘍が原発性前立腺腫瘍に由来することを示すGFPを発現する転移性腫瘍を示す。
このマウスの骨盤リンパ節は、トマトではなくGFPを発現し、この転移性腫瘍がリンパ節を追い越し、正常組織が残していないことを示している。固形前立腺腫瘍から生成された小オルガノイドの1日目に、腫瘍オルガノイド培養に存在するトマトおよびGFP発現細胞の両方で形成し始める。しかし、前立腺腫瘍オルガノイドが完全に形成された7日目以降までに、オルガノイドはGFPを発現するがトマトは発現せず、オルガノイドは正常な上皮細胞からではなく、Cre発現腫瘍細胞に由来していることを示唆している。
1日目に、トマトおよびGFP発現細胞の両方の体液充填前立腺腫瘍から生成された小さなオルガノイドの培養物がオルガノイド培養物内に存在する。しかし、体液で満たされた前立腺腫瘍のオルガノイドは、7日目以降にGFPまたはトマトのいずれかを発現し、Creを発現しない細胞から形成されたオルガノイドを示す。前立腺組織を収穫する際に向きを保つために、常に膀胱と尿道の位置に注意してください。
その生成後、オルガノイドは画像化アプリケーション、分子生物学分析および薬物スクリーンに使用することができる。
