פרוטוקול זה עבור לוקליזציה immunofluorescence in vivo, או IVIL, מעריך את ההבחנה הביולוגית in vivo של נוגדנים אבחוניים וטיפוליים או סוכנים מבוססי נוגדנים לחקר הסרטן, איתור וטיפול. בניגוד לכתמים אימונופלואורסצנטיים קונבנציונליים שבהם ביטוי תאי של אנטיגנים מתגלה ex vivo, שיטת IVIL מבהירה כיצד נוגדנים וסוכנים מבוססי נוגדנים מפיצים את החיה החיה. סרטון וידאו זה יסייע בהבנת זרימת העבודה הכוללת של שיטת IVIL.
הוא מציג פרטים חשובים לשחזור מוצלח של הפרוטוקול עבור יישומים ונוגדנים אחרים. שימו לב לעכברים מהמודל הסרטני הרצוי לגידול הגידול המתאים באמצעות מדידת דם או קליפר לפני שתמשיך. לטהר ארנב נגד עכבר B7-H3 וארנב IgG נוגדני בקרת isotype על עמוד התפלה כדי להסיר חומרים משמרים ומאגרי אחסון בעקבות הוראות היצרן.
המינונים Aliquot של 33 מיקרוגרם של כל נוגדן חידה צינורות מיקרוצנטריפוגה בודדים. לאחר הרדמה כמתואר בפרוטוקול הטקסט, היכונו לחיסון וריד הזנב של פתרונות הנוגדנים. לחטא את הזנב של החיה על ידי ניגוב שלוש פעמים עם ניגוב אלכוהול.
להתרפד על וריד הזנב על ידי התחממות עם כרית חום במשך כ 30 שניות. הימנע חימום החיה כולה. באמצעות קטטר וריד זנב 27-מד, להכניס את מחט הפרפר לתוך אחד משני ורידים זנב הצדדי.
לדמיין זרימת דם בחזרה לתוך הקטטר כדי להבטיח כי המחט ממוקמת כראוי, כך הפתרונות ייכנסו באופן מלא את החיה לעומת להיתפס בזנב. השתמש בפיסת סרט כירורגי כדי לתקן בזהירות את הזנב עם המחט מוכנס לבמה. יש לשטוף את הקטטר ב-25 מיקרוליטרים של מלוחים סטריליים עם מאגר פוספט.
לאחר מכן, להזריק את פתרון הנוגדן לתוך קטטר באמצעות מזרקי אינסולין. לשטוף את הקטטר שוב עם 25 microliters של PBS סטרילי. הסר את המחט מהזנב, והפעיל לחץ כדי לעצור כל דימום.
בצע המתת חסד הומנית של העכבר כמתואר בפרוטוקול הטקסט, והנח את העכבר בתמקמת supine. השתמש מספריים כירורגיים מלקחיים כדי למלמל רקמות הגידול. השתמש מדפים כדי לתפוס רק את השכבה החיצונית של העור בין קבוצה של בלוטות החלב הקרוב ביותר לזנב, ולעשות חתך קטן עם זוג מספריים כירורגיים.
הציגו את המספריים הסגורים לתוך החתך, ופתחו לאט את הקצה כדי להפריד בזהירות את העור ממברנת דופן הבטן שמתחת, ולשמור אותו שלם. בצע חתך אנכי את הבטן, ממשיך להפריד את העור מן הממברנה הפנימית. בין בלוטות החלב השלישית והרביעית, לעשות חתך אופקי על פני הבטן כדי לאפשר נסיגה של העור הדמיה של בלוטות החלב.
אחיזת כל גידול או בלוטה נורמלית עם מדפים, בזהירות לקצץ את העור המצורף באמצעות מספריים כירורגיים. מניחים רקמות מגולגלות לתוך תבניות בסיס חד פעמיות רקמות כי הם prelabeled ומלא טמפרטורת חיתוך אופטימלית הטמע בינוני. להקפיא במהירות את התבניות על ידי מיקום על קרח יבש.
על מנת ללמוד משלוח מחוץ ליעד, excise רקמות אחרות או איברים של עניין. באמצעות קריוסטט, קטע בלוקים רקמה קפואה בעובי 10 מיקרון, ולהציב קטעים סמוכים על מגלשות זכוכית הידבקות prelabeled. לשטוף שקופיות רקמה קפואה עם PBS טמפרטורת החדר במשך חמש דקות כדי להסיר את המדיום הטבעה.
תיחום מקטעי רקמה עם עט מחסום הידרופובי כדי להפחית את נפח הפתרונות הדרושים במהלך הכתמים. תקן את מקטעי הרקמה עם פתרון paraformaldehyde 4% במשך חמש דקות. לאחר שטיפת השקופיות ב- PBS במשך חמש דקות, מחלחלים מקטעי רקמה עם 0.5% טריטון X-100 ב- PBS במשך 15 דקות.
שטפו שוב את השקופיות ב-PBS למשך חמש דקות. חסום את הרקמות עם PBS המכיל 3% משקל לכל אלבומין סרום בקר נפח ו 5% נפח לכל סרום עיזים נפח במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת השקופיות ב- PBS במשך חמש דקות, הדגירה את החלקים עם נוגדנים ראשוניים לשמירת שיא כגון סמן גרעיני, כלי דם או ציטופלסמי משותף.
כאן, עכבר נגד עכבר CD31 משמש בדילול של אחד עד 100 בתת פתרון החסימה. המגלשות עם הנוגדן העיקרי נשארות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס, מוגנות מהתייבשות על מגש מגלשה. לאחר הדגירה, שטפו את השקופיות ב-PBS במשך חמש דקות שלוש פעמים.
שנה את ה- PBS בכל פעם. הדגירה את המגלשות עם נוגדנים משניים כדי לתייג את הנוגדנים העיקריים. עבור יישום זה, לדמיין נוגדן אנטי B7-H3 באמצעות אלקסה פלואור 546 נדנוגדן נגד ארנב עזים, ולדמיין CD31 עם אלקסה פלואור 488 עז נוגדן משני נגד עכברוש בתתכונת חסימה.
הגן על השקופיות מפני אור והתייבשות על מגש שקופיות למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת השקופיות ב- PBS כבעבר, יש למרוח טיפה אחת של מדיום ההרכבה במרכז פרוסת הרקמה. בזהירות למקם כיסוי, הימנעות מלכוד של בועות אוויר.
לאטום את הקצוות של כיסוי עם לק ברור, ולאפשר להתייבש. המשך בהדמיית מיקרוסקופיה קונפוקפלית וניתוח תמונה כמותית כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מיקרוגרפים קונפוקליים מייצגים מראים את ההשוואה בין נוגדנים-ICG ספציפיים של B7-H3 לבין לוקליזציה של נוגדנים שאינם ספציפיים לבקרת isotype-ICG בבלוטות החלב המורי המכילות רקמות נורמליות או קרצינומה.
בלוטות החלב מורין נורמליות של בעל חיים מוזרק דרך הווריד עם Iso-ICG או B7-H3-ICG ו counterstained עם CD31 להראות שום כתמים של תקע הנוגדן. רקמות נורמליות הוכחו אין ביטוי של B7-H3 על ידי כתם immunofluorescence אקס ויוו סטנדרטי. בגידולים מחניים פולשניים, B7-H3-ICG נקשר בחוזקה כלי הדם, הנקודה הראשונה של מגע ב vivo, ולאחר מכן הוא מסוגל להתפזר מן כלי הדם כדי להכתים את האפיתל הגידול.
Iso-ICG מראה הצטברות לא ספציפית בתוך רקמות הגידול. כתם אימונופלואורסצנטי אקס ויוו סטנדרטי מראה ביטוי אחיד של סמן B7-H3 על תאי אפיתל ו אנדותל. מיקרוגרפים קונפוקלים מייצגים מראים את שיטת לוקליזציה אימונופלואורסצנטיות in vivo כדי לזהות ביטוי netrin-1 או ביטוי בקרת isotype ב קרצינומה של מורין ובלוטות החלב הרגילות.
לוקליזציה immunofluorescence In vivo מאשר אות אפיתל עבור netrin-1 בגידולים MMTV-PyMT אבל לא בבלוטות החלב נורמלי. יתר על כן, יש אות netrin-1 חזק על תאים אנדותל בגידולים בשד, כפי שצוין על ידי אות צהוב colocalized. האות חלש משמעותית בבלוטות החלב הרגילות.
שיטת IVIL תצטרך להיות אופטימיזציה במונחים של מינון נוגדנים, תזמון איסוף רקמות, ודילול נוגדנים משני ליישום מוצלח. IVIL מאפשר מיקוד של אפיטופים קונפורמיים שלא ניתן לזהות באמצעות כתם immunofluorescence סטנדרטי, אשר דורש עיבוד רקמות. כמו כן, איברים בריאים של עכברים נושאי גידול ניתן לאסוף כדי להעריך משלוח מחוץ ליעד של נוגדנים טיפוליים.
עם שימוש מוגבר של נוגדנים מבוססי תרפיה וסוכני ניגודיות במחקר וניהול סרטן, שיטת IVIL ישימה מאוד מחקר ופיתוח תרופות. חוקרים בטיפולים בסרטן, הדמיה מולקולרית, דלקת, ותחומים אחרים עשויים למצוא כי שיטת IVIL מספק מידע שימושי.
