פיתחנו שיטה יעילה וחסכונית להקמת עכברים עם מניפולציה בגנים במיוחד בתאי גזע hematopoietic, באמצעות טכנולוגיית עריכת גנום ומערכות העברת טרנסג'נדרים מתווכים lentivirus. היתרון של פרוטוקול זה הוא שאנחנו יכולים ליצור מודלים של בעלי חיים מחסה מוטציות ספציפיות בתאים hematopoietic בצורה מהירה וחסכונית בהשוואה לגישות מהודרות עכבר קונבנציונלי. הדגמת ההליך תהיה יינג וונג, חוקר מהמעבדה שלי.
כדי ליצור חלקיקי lentivirus, להתחיל על ידי קידוד צלחת שש גם עם תווי קולגן דגירה אותו ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 30 דקות. לאחר מכן, זרע 293T תאים על הצלחת הדגירה אותו עוד שעתיים. בינתיים, להכין את התערובת של שלוש פלסמידים transfection על ידי שילוב של 0.9 מיקרוגרם של וקטור lentivirus, 0.6 מיקרוגרם של psPAX2 ו 0.3 מיקרוגרם של pMD2.
G ו deionized ל 10 microliters לכל באר. לאחר מכן, מוסיפים בזהירות 50 מיקרוליטרים של 1X PBS וחמישה מיקרוליטרים של PEI MAX מדולל לתערובת הפלסמיד, ומדגרים את התערובת בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. לאחר הדגירה, הוסף מיליליטר אחד של DMEM.
שאפו את התקשורת מצלחת ששת הטובים והוסיפו מיליליטר אחד של תערובת פלסמיד לכל באר. דגירה הצלחת לעוד שלוש שעות. החלף את המדיה ב- DMEM טרי ודגירה למשך 24 שעות.
הוסיפו מיליליטר אחד של DMEM טרי והתווספו 24 שעות נוספות. לאחר הדגירה הכוללת של 48 שעות, מעבירים את העל-טבעי לצינור של 50 מיליליטר ומעבירים אותו ב-3000 פעמים G למשך 15 דקות כדי להסיר תאים צפים חופשיים. סנן את העל-טבעי באמצעות מסנן מיקרומטר 0.45 ולחץ עליו צנטריפוגה למשך שלוש שעות.
בזהירות שאף את העל-טבעי, והשאיר מאחור את גלולת הלבן. להשעות מחדש את גלולה עם 100 microliters של סרום חינם hematopoietic התא הרחבת מדיום ללא אוויר. שמור aliquot 10 microliter למדוד את טיטר ויראלי ולאחסן את שאר ההשעיה במינוס 80 צלזיוס עד מוכן לשימוש.
לאחר בידוד העצמות, מניחים אותם לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר עם RPMI ומניחים את הצינור על קרח. בארון ביו-בטיחות, העבר את העצמות לצלחת תרבות סטרילית של 100 מילימטר. ואז לתפוס עצם עם מדפים קהים, ולהשתמש מספריים ניתוח לחתוך בזהירות את שני האפיפיזיות.
מלא מזרק 10 מיליליטר עם RPMI קר כקרח ולהשתמש מחט 22 מד לשטוף את מח העצם מהפיר לתוך צלחת תרבות חדשה 100 מילימטר. אחרי כל מח העצם נאסף, להפוך את ההשעיה תא יחיד על ידי העברת מח העצם דרך מזרק 10 מיליליטר עם מחט 18 מד. לסנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר.
ואז צנטריפוגה הצינור על פי הוראות כתב היד ושואפים את העל-טבעי. השהה מחדש את כדורי התא באמצעי אחסון מתאים של מאגר הפרדה ממוטב. כדי לבודד תאים שליליים בשושלת, השתמש בערכת דלדול תאי שושלת בהתאם להוראות היצרן.
להשעות מחדש את התאים השליליים שושלת מבודדת במדיום הרחבת תא hematopoietic ללא סרום. לפני הדגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5%פחמן דו חמצני במשך שעתיים. לאחר מכן מוסיפים lentivirus על פי הוראות כתב היד ולהשאיר את התאים באינקובטור עוד 16 עד 20 שעות.
למחרת, לאסוף את התאים lentivirus-מתמר בצינור חרוט 15 מיליליטר צנטריפוגה אותם ב 300 פעמים G במשך 10 דקות. על פי הנחיות NHA, חשוב לטפל וקטורים lentivirus בקבוצת ריס רמה שתיים. יש לנקוט באמצעי זהירות, בהתאם לתקנות המתקן.
בזהירות שאפו את העל-טבעי והשעו מחדש את גלולת הכדור ב-200 מיקרוליטרים של RPMI לעכבר. שמור על התאים בטמפרטורת החדר עד להשתלה לעכברים. לאחר סשן ההקרנה השני, מזריקים רטרו-מסלולית תאים שליליים מתומרים לכל עכבר הרדמה באמצעות מזרק אינסולין.
שלושה עד ארבעה שבועות לאחר השתלת מח עצם, להשיג דגימות דם מן וריד רטרו-מסלולית באמצעות צינורות נימי. מעבירים 20 מיקרוליטרים של דם למבחנות פוליסטירן עגולות וממקמים על קרח. לאחר תזה RBC, לה הדגירה את התאים עם קוקטייל של נוגדנים חד שבטיים בחושך במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר הדגירה, לשטוף, לתקן צנטריפוגה את התאים מחדש להשעות את גלולת התא ב 400 microliters של מאגר FACS. שמור את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס עד ניתוח על ידי ציטומטריית זרימה. הצלחה של התפלת תאים שליליים שושלת ניתן להעריך עם זיהוי ציטומטרי זרימה של RFP.
הוכח כי לאחר שבעה ימים של תרבות במבחנה, בממוצע, 75.7% מהתאים מתומרים. ציטומטריית זרימה שימשה גם לניתוח דם היקפי של העכבר לאחר ארגון מחדש עם תאי גזע המטופויטיים מתומרים ולא מתומרים. ממוצע של 94.8% של נויטרופילים, 93.5% של מונוציטים, ו 82.7% של תאים B להביע RFP.
דנ"א גנומי מתאים חיוביים RFP כבר PCR מוגברת ותת משובטה לניתוח רצף. מוטציות שונות מזוהות ו-69% מהשכפולים מראים מוטציות מחוץ למסגרת או עצירה מוקדמת. כדי להצליח עם הליך זה, הכנת מלאי אנטי וירוס גבוה ותנאים אופטימיזציה עבור התפלה והשתלה של תאים hematopoietic נדרשים.
יישמו טכניקה זו כדי ללמוד את החוק של מחלת לב וכלי דם. אבל זה גם שימושי ללמוד ממאירות המטולוגית. שיטה זו מאפשרת לנו לחקור את הפונקציות של סוגים חדשים של גנים במערכת hematopoietic בצורה יעילה וגבוהה.
אנחנו אוספים את זה על הזמינות של עכברים מהו מהודרים.
