שיטה זו מאפשרת מידול מדויק של מוטציות רווח תפקוד לוקמוגניות חוזרות ונשנות בתאי גזע ותאי אב המטופויאטיים אנושיים ראשוניים, ובכך לחקור את התפקיד בטרנספורמציה הלוקמית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהנדסת המוטציות המבוססת על CRISPR-Cas9 משולבת עם הכנסת כתב פלואורסצנטי. זה מאפשר באופן ייחודי זיהוי, העשרה ומעקב אחר אוכלוסיות תאים טהורות עם מוטציה הטרוזיגוטית.
מי שידגים את ההליך יהיה טומאסו סקונוצ'יה, עמית מחקר בתר-דוקטוריאלי מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, תכנן את ה- RNA של המדריך היחיד באמצעות כלי התכנון המקוון Benchling על ידי בחירה באפשרות יצירת פלוס. לאחר מכן, לחץ על רצף דנ"א "ואחריו ייבוא רצפי דנ"א" וייבוא ממאגרי מידע".
לאחר מכן הזן את הגן הרצוי ובחר את האדם כמין. לחץ על אפשרות החיפוש ובחר את ייבוא התמליל הנכון. בחר את אזור העניין שבו להציג את הפסקה גדיל כפול.
לאחר מכן בחר באפשרות CRISPR בצד ימין של המסך, ולאחר מכן עצב ונתח קווי עזר. לאחר מכן, בחר מדריך יחיד"תוך שמירה על אורך המדריך ל-20 זוגות בסיסים ורצף PAM לעריכה עם SP-Cas9. בחר מדריך עם ציון גבוה למטרה וציון גבוה מחוץ למטרה והזמן את ה- RNA המדריך היחיד כ- RNA מדריך יחיד שעבר שינוי כימי מספק מסחרי.
כדי לעצב את תבנית HDR, ייבא את הרצף הגנומי ואת רצף הקידוד לתוכנה לשיבוט מולקולרי. מקובץ הרצף הגנומי, עצב את זרוע ההומולוגיה השמאלית על-ידי בחירה, באופן אידיאלי, 400 זוגות בסיסים בחמשת הקצוות הראשוניים של מעברי הגדילים הכפולים והדבק רצף זה בקובץ חדש. מקובץ הרצף הגנומי, עצבו את רצף מקבל השחבור על ידי בחירת 150 זוגות הבסיסים האחרונים של האינטרון הממוקד והדבקתו לאחר זרוע ההומולוגיה השמאלית.
מקובץ רצף הקידוד, בחר את ה- cDNA המעניין. קודון מייעל את ה-cDNA ומכניס אותו לאחר רצף מקבלי השחבור. לאחר ה-cDNA המעניין, הכנס אות פוליאדנילציה של שלושה ראשים בעקבות רצף מקדם עבור החלבון הפלואורסצנטי.
לאחר מכן, הכנס את הרצף עבור החלבון הפלואורסצנטי ואות פוליאדנילציה שני, אך שונה. מתוך קובץ הרצף הגנומי, תכנן את זרוע ההומולוגיה הימנית על ידי בחירה אידיאלית של 400 זוגות בסיסים בשלושת הקצוות הראשוניים של מעברי הגדילים הכפולים והכנס את הרצף לאחר הפוליאדנילציה השנייה. לאחר מכן, צור עותק של התבנית כולה ושנה את ה- cDNA של העניין כך שהוא יכיל את רצף המוטציה הרצויה.
החליפו את החלבון הפלואורסצנטי בחלבון פלואורסצנטי אחר. בנה ושכפל את תבניות ה- HDR לווקטור הביטוי AAV. להכנת AAV6 רקומביננטי, הכינו 10 מנות 150 מילימטר שכל אחת מהן מכילה 11 מיליון HECK293T ב-20 מיליליטר DMEM בתוספת 10%FBS, 1% פניצילין סטרפטומיצין ו-25 מילימולר HEPES.
לאחר מכן, מניחים את הכלים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני, במשך 24 שעות. לאחר השלכה זהירה של המדיום הישן, החליפו אותו ב-20 מיליליטר של DMEM נטול אנטיביוטיקה בתוספת 10% FBS, 25 מילימולר HEPES ומילימולאר אחד נתרן בוטיראט. לאחר מכן, להכין שני צינורות 15 מיליליטר שכותרתו צינורות אחד ושניים.
כדי צינור אחד, להוסיף חמישה מיליליטר של מדיום סרום מופחת, 60 מיקרוגרם של פלסמיד HDR רקומביננטי AAV6 מוטציה, ו 220 מיקרוגרם של פלסמיד עוזר PDGM6. כדי צינור שני, להוסיף חמישה מיליליטר של בינוני סרום מופחת ו 1120 microliters של מיליגרם אחד לכל מיליליטר פוליאתילן אמין פתרון. לאחר הוספת התוכן של צינור שתיים לצינור אחד, מערבלת במשך 30 שניות, ולאחר מכן דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
מוסיפים בזהירות 1.1 מיליליטר של התמיסה לכל מנה ומפיצים על ידי מערבולת עדינה. מניחים את הכלים בחממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני, במשך 48 שעות. לאחר מכן להוסיף 250 microliters של 0.5 EDTA טוחנת לכל צלחת ומניחים אותם באינקובטור במשך 10 דקות.
קציר התאים על ידי שטיפתם מהתבשיל והעברתם לצינור צנטריפוגה של 500 מיליליטר. צנטריפוגה ב 2000 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant. שחררו את הכדור על ידי מערבולות והוציאו את הנגיף באמצעות ערכת טיהור AAV.
לאחר aliquoting את הנגיף מטוהר, לאחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר הפשרת תאי גזע ותאי אב המטופויאטיים חיוביים ל-CD34, מעבירים את התאים ל-10 מיליליטר של RPMI שחומם מראש בתוספת סטרפטומיצין 1% פניצילין. צנטריפוגה ב-350 גרם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
להשעות את התאים בגזע hematopoietic ותאי אב שימור בינוני לריכוז של 250, 000 תאים למיליליטר ולדגור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 72 שעות. לאחר מכן, לקצור את התאים בצינור 15 מיליליטר. לספור ולבדוק את כדאיות התא על ידי הרחקה כחולה טריפאן.
כדי להכין את קומפלקס ריבוקוקלאופרוטאין, הוסף 15 מיקרוגרם של Cas9 ושמונה מיקרוגרם של RNA מדריך יחיד בצינור 1.5 מיליליטר ודגרה ב 25 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות בבלוק חימום. בזמן שקומפלקס הריבונוקלאופרוטאין דוגר, צנטריפוגה של התאים ב-350 G למשך חמש דקות והשליכו את הסופר-נטנט. לאחר השעיית התאים ב -100 מיקרוליטרים של תמיסת נוקלאופקציה, מערבבים את התאים עם קומפלקס הריבונוקלאופרוטאין ומעבירים אותם לקובט.
לאחר הקשה עדינה על הקובטה כדי להסיר שאריות של בועות אוויר, הכנס את הקובט למחזיק של מערכת הטרנספקציה וחשמל את התאים. מיד לאחר האלקטרופורציה, הוסיפו 400 מיקרוליטרים של גזע המטופויאטי שחומם מראש ואמצעי שימור תאי אב ללא סטרפטומיצין פניצילין והעבירו את התאים עם פיפטה העברה עדינה לצלחת תרבית המכילה גזע המטופויאטי שחומם מראש ומדיום שימור תאי אב ללא סטרפטומיצין פניצילין. לאחר מכן מעבירים את הצלחת לאינקובטור.
הפשירו את הבקבוקונים המכילים את ה-AAVs הרקומביננטיים הקפואים על הקרח והתמרו את התאים על ידי הזרמת הכמות האופטימלית של כל AAV6 רקומביננטי לתרחיף התא. לאחר ערבוב עדין של תרחיף התאים עם הפיפטה, דגירה של התאים המתמרים למשך שש עד שמונה שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. לאחר שש עד שמונה שעות, אספו את התאים בצינור וצנטריפוגה שלהם ב-350 גרם בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.
השליכו את הסופר-נטנט והחליפו אותו בגזע המטופויאטי טרי שחומם מראש ובמדיום שימור תאי אב בתוספת סטרפטומיצין פניצילין והעבירו את התאים לצלחת תרבית תאים. לדגור על התאים במשך 48 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. כדי להזרים למיין את התאים המהונדסים הנושאים את מוטציית רווח התפקוד ההטרוזיגוטית, קצרו את התאים בצינור של 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב-350 גרם בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות כפי שהוכח קודם לכן.
הסר את הסופר-נאטנט והשהה את התאים במיליליטר אחד של DPBS המכיל 0.1% PSA וצנטריפוגה שוב ב-350 G בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר השלכת הסופרנטנט, השעה את התאים בנפח מתאים של DPBS בתוספת 0.1% BSA בהתאם למספר התא כפי שהוכח קודם לכן. העבירו את התאים לצינור פקס סטרילי המצויד בכובע והוסיפו שבעה צבעי AAD או צבע כדאיות אחר לתרחיף התא לצורך הרחקת תאים חיים/מתים.
מיין את התאים החיים שהם חיוביים כפולים עבור חלבוני הכתב הפלואורסצנטי לצינור איסוף המכיל 200 מיקרוליטרים של גזע המטופויאטי ומדיום שימור תאי אב. לאחר צנטריפוגה של התאים הממוינים ב 350 G בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות כפי שהוכח קודם לכן, לריכוז של 250, 000 תאים למיליליטר להרחבה נוספת בתרבית או להשתמש בתאים ישירות לבדיקות פונקציונליות. יומיים לאחר טרנסווקציה עם קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין והתמרה עם נגיפי AAV6 רקומביננטיים, נותחו התאים על ידי ציטומטריה של זרימה.
זוהו ארבע אוכלוסיות עיקריות, כולל תאים ללא עריכת גנום מבוססת HDR המבטאים לא את ה-GFP ולא את תאי ה-BFP חיוביים רק עבור GFP כאשר רק מבנה הסוג הפראי משולב, תאים חיוביים רק עבור BFP כאשר רק המבנה שעבר מוטציה משולב, ותאים חיוביים כפולים של GFP ו-BFP עם שילוב של סוג הבר ושל רצפים שעברו מוטציה. כדי לאמת את הדפיקה המוצלחת של מוטציות הקלרטיקולין ההטרוזיגוטיות פנימה/החוצה PCR בוצע על דנ"א גנומי שחולץ מתאים דגירה עם AAV בלבד ומתאים דגירה עם ריבונוקלאופרוטאין ו- AAV עם סוג הבר של קלרטיקולין ורצף מחיקת קלרטיקולין. התאים מוינו על סמך הביטוי הסימולטני של שני הכתבים הפלואורסצנטיים לפני מיצוי הדנ"א.
לאחר אלקטרופורזה בג'ל, רצועות בודדות נכרתו מהג'ל ודנ"א הופק לריצוף סנגר לאחר מכן. תוצאות הריצוף אישרו את האינטגרציה החלקה המוצלחת של הסוג הפראי והרצפים שעברו מוטציה בתאי גזע ותאי אב המטופויאטיים בעלי מוטציה הטרוזיגוטית. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בעת ניסיון הליך זה הוא לבחור בקפידה את ה- RNA המדריך היחיד בעל הביצועים הטובים ביותר, שכן זה יקבע את יעילות ה- HDR הכוללת, ולכן, את תדירות הדפיקה המוצלחת של מוטציות הטרוזיגוטיות.
לאחר הליך זה, התאים המהונדסים גנטית יכולים לשמש לניסויים פונקציונליים במבחנה וב-in-vivo כגון מבחני יחידות יוצרות מושבה, מבחני התמיינות והשתלה בעכברים עם מחסור במערכת החיסון.
