פרוטוקול זה משמש למיפוי ואפליה של התמלילים העיקריים והמעובדים במיטוכונדריה תירס. טכניקה זו כוללת צעד נורמליזציה של RNA והיא ממזערת את ההשפעה של חמישה טריפוספטים ראשוניים לא יציבים המעכבים אפליה ברורה בין התמלילים הראשיים והמעובדים. מלבד מיטוכונדריה תירס, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על plastids ומיטוכונדריה צמח אחרים.
התחל על ידי איסוף 20 גרם של גרעינים פיתוח לתוך צינור 50 מיליליטר על קרח. מעבירים את הגרעינים למרגמה מקוררת מראש ומוסיפים 10 עד 20 מיליליטר של חיץ מיצוי קר כקרח. טוחנים את הגרעינים לחלוטין, מוסיפים מאגר מיצוי נוסף ומסננים את רקמת הקרקע דרך שתי שכבות של בד מסנן.
צנטריפוגה לסינון ב 8, 000 פעמים G במשך 10 דקות. ואז להעביר את העל טבעי לצינור חדש ולהשליך את הסינון. צנטריפוגה הצינור ב 20, 000 פעמים G במשך 10 דקות.
יוצקים את supernatant ולהשעות מחדש את גלולה בשישה מיליליטר של חיץ לשטוף. עליות ההשעיה לתוך חמישה צינורות 1.5 מיליליטר RNase חינם צנטריפוגה אותם ב 14, 000 פעמים G במשך חמש דקות. השליכו את העל-טבעי והקפיאו את גלולת המיטוכונדריה בחנקן נוזלי.
יש לחלץ RNA מיטוכונדריאלי באמצעות רייגנטים מסחריים בהתאם להוראות היצרן ולהגדיר טיפול RNA חמישה פוליפוספטזה מעולה. לאחר מכן, לשחזר את RNA עם ערכת טיהור RNA. הריג'נט המשמש לחילוץ רנ"א מסוכן.
תמיד לעבוד עם זה ברדס אדים ותמיד ללבוש חלוק מעבדה וכפפות. הכינו שתי תגובות מעגליות באמצעות אותן כמויות של חמישה פוליפוספטזה ראשוניים שטופלו ו-RNA מיטוכונדריאלי שאינו מטופל. דגירה שתי התגובות ב 16 מעלות צלזיוס במשך 12 עד 16 שעות ולאחר מכן לשחזר את RNA עצמית קשירה עם ערכת טיהור RNA בשימוש בעבר.
התחל על ידי הכנת תערובת פריימר עם יחס שווה של 26 SCRT ועד שבעה פריימרים שעתוק הפוך אחרים. להרכיב שתי מערכות תגובת שעתוק הפוכות על פי הוראות כתב היד ולהדיגר אותם ב 42 מעלות צלזיוס במשך 50 דקות. כדי לנרמל את ה- cDNA, הכן שתי תגובות PCR עם אותו נפח של cDNA מחמשת הפוליפוספטזה העיקריות שטופלו או לא טופלו של RNA ולהפעיל את התגובה תחת תנאי התרמוצ'ילי המתוארים בכתב היד.
נורמליזציה על ידי rRNA בוגרת 26S הוא צעד מפתח להפלות בין התעתיקים הראשיים והמעובדים. השווה את השפע של שני מוצרי PCR ובהכרחי, מטב את הנורמליזציה על-ידי התאמת כמויות ה- cDNA של התבנית. הכינו זוגות של תגובות PCR עם כרכים מתאימים של cDNA מנורמל וזוג פריימרים שונים כמו בחמישה ראשוניים עד שלושה צומת הממשלה של תעתיקי היעד ולבצע PCR על פי הוראות כתב היד.
לאחר מכן, השתמש בערכת שחזור DNA ג'ל כדי לבודד את הרצועות הבולטות המוגברות על ידי PCR מקונן. לשכפל את מוצרי PCR מטוהרים ג'ל לתוך וקטור באמצעות טכניקות סטנדרטיות ולבצע PCR המושבה כדי לבחור שיבוטים חיוביים המכילים את היעד מוסיף. רצף מוצרי PCR וליישר את נתוני הרצף עם הגנום המיטוכונדריאלי תירס באמצעות כלי חיפוש יישור מקומי בסיסי או BLAST.
בחר את אוסף הנוקלאוטיד של תירס האורגניזם וחפש במסד הנתונים. מצא את חמשת הצומתים המובילים עד שלושה של התמליל המעגלי וקבע את עמדות חמשת התעתיקים המובילים ושלושת התעתיקים. להגביר את שבר ה-DNA המשמש להכנת בדיקה RNA ולשכפל אותו לווקטור בשימוש בעבר המכיל מקדם T7, 17 זוגות בסיס במעלה הזרם של אתר הכניסה.
תווית בדיקות RNA עם dig-11-UTP ולבצע הכלאה RNA באמצעות ערכות מסחריות. הפלה את חמשת הקצוות הראשוניים והמעובדים על ידי השוואת מוצרי RT-PCR המעגליים המתקבלים מחמשת הפוליספטזה העיקריים המנורמלים שטופלו ולא טופלו ב- RNA. לאחר מכן, תכנן פריימרים כמותיים של RT-PCR בהתבסס על תוצאות המיפוי ואמת את תוצאות האפליה באמצעות RT-PCR.
הגן COX-2 שימש כדוגמה להדגמת המיפוי והאפליה של תעתיקי מיטוכונדריה תירס עם האסטרטגיה המעגלית מבוססת RT-PCR. CDNA של מנורמל שימשו תבניות עבור PCR, אשר הביא שתי להקות בולטות מוגברת מתוך חמשת מדגם פוליפוספטזה הממשלה מטופלים. שתי הלהקות נקראו COX-2 אחת ושתיים התאוששו מהסם ושכפלו לווקטורים.
תוצאות PCR המושבה הראו כי שיבוטים חיוביים מכילים מוסיף עם גודל משתנה אשר מרמז כי termini יש הטרוגניות חמש פריים או שלושה טרמיני הממשלה. תוצאות הרצף הראו כי COX-2 אחד ושניים יש את אותם שלושה קצוות ראשוניים ב 39 נוקלאוטידים במורד הזרם של עצירת codon בעוד חמשת termini הממשלה שלהם ממוקמים ב 992 כדי 1, 030 ו 1, 276 כדי 1, 283 נוקלאוטידים במעלה הזרם של קודון ההתחלה, בהתאמה. היברידיות כתם ג'ל RNA בוצעה כדי לאמת את תוצאות מיפוי RT-PCR מעגלי ושתי להקות עיקריות עם גדלים דומים COX-2 אחד ושניים זוהו.
זוג פריימרים שונים נוספים תוכננו להגביר את ה-COX-2 שלוש וארבע להקות שזוהו עם כתם ג'ל RNA אך לא עם RT-PCR מעגלי בפעם הראשונה. תוצאות RT-PCR הכמותיות אישרו כי COX-2 אחד, שתיים, שלוש וארבע היו רגישים לחמישה פוליפוספטזה עיקרית ושעבורם חמישה טרמיני ראשוניים ראשוניים. ניתן לבצע ניתוח הרחבת פריימר כדי לאמת את חמש תוצאות המיפוי העיקריות למרות שהוא אינו כלול בפרוטוקול זה.
