Dieses Protokoll wird für die Kartierung und Diskriminierung der primären und verarbeiteten Transkripte in Maismitochondrien verwendet. Diese Technik beinhaltet einen RNA-Normalisierungsschritt und minimiert den Einfluss von instabilen fünf Primetriphosphat, die eine klare Diskriminierung zwischen dem primären und den verarbeiteten Transkripten behindert. Neben Maismitochondrien könnte diese Methode auch auf Plastide und andere pflanzliche Mitochondrien angewendet werden.
Beginnen Sie mit dem Sammeln von 20 Gramm sich entwickelnden Kernen in einer 50 Milliliter Tube auf Eis. Die Kerne auf einen vorgekühlten Mörtel übertragen und 10 bis 20 Milliliter eiskalten Extraktionspuffer hinzufügen. Schleifen Sie die Kerne vollständig, fügen Sie mehr Extraktionspuffer hinzu und filtern Sie das geschliffene Gewebe durch zwei Schichten Filtertuch.
Zentrifugieren Sie das Filtrat bei 8 000 mal G für 10 Minuten. Dann den Überstand in ein neues Rohr geben und das Filtrat entsorgen. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 20.000 mal G für 10 Minuten.
Gießen Sie den Überstand ab und hängen Sie das Pellet in sechs Milliliter Waschpuffer wieder auf. Aliquot die Suspension in fünf 1,5 Milliliter RNase-freie Rohre und zentrifugieren sie bei 14. 000 mal G für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und frieren Sie das mitochondriale Pellet in flüssigem Stickstoff ein.
Extrahieren Sie mitochondriale RNA mit kommerziellen Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers und richten Sie eine BEHANDLUNG mit fünf Prime Polyphosphaatase aus. Dann erholen Sie die RNA mit einem RNA-Reinigungskit. Das für die RNA-Extraktion verwendete Reagenz ist gefährlich.
Arbeiten Sie immer mit ihm in einer Dunstabzugshaube und tragen Sie immer Labormantel und Handschuhe. Bereiten Sie zwei Zirkularisierungsreaktionen mit den gleichen Mengen von fünf Prime Polyphosphatase behandelt und nicht behandelt mitochondrialen RNA. Inkubieren Sie beide Reaktionen bei 16 Grad Celsius für 12 bis 16 Stunden und erholen Sie dann die selbstgeligaten NAs mit einem zuvor verwendeten RNA-Reinigungskit.
Beginnen Sie mit der Vorbereitung einer Primermischung mit einem gleichen Verhältnis von 26 SCRT und bis zu sieben weiteren Reverse-Transkriptions-Primern. Montieren Sie zwei Reverse-Transkriptionsreaktionssysteme nach den Manuskriptrichtungen und inkubieren Sie sie bei 42 Grad Celsius für 50 Minuten. Um die cDNA zu normalisieren, bereiten Sie zwei PCR-Reaktionen mit dem gleichen Volumen von cNDS aus den fünf prime polyphosphatase behandelten oder nicht behandelten RNA s und führen Sie die Reaktion unter thermocycling Bedingungen im Manuskript beschrieben.
Die Normalisierung durch 26S reife rRNA ist ein wichtiger Schritt, um zwischen dem primären und den verarbeiteten Transkripten zu unterscheiden. Vergleichen Sie die Häufigkeit der beiden PCR-Produkte und optimieren Sie ggf. die Normalisierung, indem Sie die Mengen der Template-CDLs anpassen. Bereiten Sie Paare von PCR-Reaktionen mit entsprechenden Volumina normalisierter CDAs und einem Paar divergierender Primer wie in den fünf Primzahl- bis drei Prim-Junction der Zieltranskripte vor und führen Sie PCR entsprechend den Manuskriptrichtungen durch.
Verwenden Sie dann ein Gel-DNA-Recovery-Kit, um die prominenten Bänder zu isolieren, die durch verschachtelte PCR verstärkt werden. Klonen Sie die gelgereinigten PCR-Produkte mithilfe von Standardtechniken in einen Vektor und führen Sie Kolonie-PCR durch, um positive Klone auszuwählen, die die Zieleinsätze enthalten. Sequenzieren Sie die PCR-Produkte und richten Sie die Sequenzierungsdaten mit dem mitochondrialen Maisgenom mithilfe des grundlegenden lokalen Ausrichtungssuchwerkzeugs oder BLAST aus.
Wählen Sie den Organismus Mais und Suchdatenbank Nukleotid Sammlung. Finden Sie die fünf Prim- bis drei Hauptknoten des kreisförmigen Transkripts und bestimmen Sie die Positionen der fünf Prime- und drei Prime-Transkript-Termini. Verstärken Sie das DNA-Fragment, das zur Vorbereitung der RNA-Sonde verwendet wird, und klonen Sie es auf den zuvor verwendeten Vektor, der einen T7-Promotor enthält, 17 Basenpaare vor der Einfügestelle.
Beschriften Sie die RNA-Sonden mit dig-11-UTP und führen Sie die RNA-Hybridisierung mit kommerziellen Kits durch. Diskimperieren Sie die primären und verarbeiteten fünf Hauptenden, indem Sie die kreisförmigen RT-PCR-Produkte vergleichen, die aus den normalisierten fünf primierten Polyphosphatase behandelten und nicht behandelten RNA s gewonnen wurden. Entwerfen Sie dann quantitative RT-PCR-Primer basierend auf den Mapping-Ergebnissen und überprüfen Sie die Diskriminierungsergebnisse mit RT-PCR.
Das COX-2-Gen wurde als Beispiel verwendet, um die Kartierung und Diskriminierung von Maismitochondrial-Transkripten mit der kreisförmigen RT-PCR-basierten Strategie zu demonstrieren. Die normalisierten cDNA es wurden als Schablonen für PCR verwendet, was zu zwei prominenten Bändern führte, die aus der fünf hauptpolyphosphatase behandelten Probe verstärkt wurden. Die beiden Bänder wurden COX-2 eins und zwei aus dem Gel geborgen und in Vektoren geklont.
Die Ergebnisse der Kolonie-PCR zeigten, dass die positiven Klone Inserts mit variabler Größe enthalten, was impliziert, dass die Termini heterogene fünf Prime- oder drei Prime-Termini aufweisen. Die Sequenzierungsergebnisse zeigten, dass COX-2 eins und zwei die gleichen drei Primlägeden bei 39 Nukleotiden unterhalb des Stop-Codons haben, während ihre fünf Prime-Termini bei 992 bis 1, 030 bzw. 1, 276 bis 1, 283 Nukleotiden vor dem Startcodon liegen. Die RNA-Gel-Blot-Hybridisierung wurde durchgeführt, um die kreisförmigen RT-PCR-Mapping-Ergebnisse zu überprüfen, und es wurden zwei Hauptbänder mit Größen ähnlich wie COX-2 eins und zwei nachgewiesen.
Ein weiteres Paar divergenter Primer wurde entwickelt, um die COX-2 drei und vier Bänder zu verstärken, die mit dem RNA-Gel-Blot, aber nicht mit dem ersten kreisförmigen RT-PCR nachgewiesen wurden. Die quantitativen RT-PCR-Ergebnisse bestätigten, dass COX-2 eins, zwei, drei und vier empfindlich auf fünf Prime-Polyphosphatase reagierten und dass sie primäre fünf Prime-Termini hatten. Primer-Erweiterungsanalyse könnte durchgeführt werden, um die fünf Prim-Mapping-Ergebnisse zu überprüfen, obwohl sie nicht in diesem Protokoll enthalten sind.
