Bu protokol, mısır mitokondrisinde birincil ve işlenmiş transkriptlerin haritalandırılması ve ayrımcılığı için kullanılır. Bu teknik bir RNA normalleştirme adımı içerir ve birincil ve işlenmiş transkriptler arasında net bir ayrımcılık engelleyen kararsız beş prime trifosfat etkisini en aza indirir. Mısır mitokondrisi yanı sıra, bu yöntem plastidler ve diğer bitki mitokondri uygulanabilir.
Buz üzerinde 50 mililitrelik bir tüp içine gelişmekte olan çekirdekleri 20 gram toplayarak başlayın. Çekirdekleri önceden soğutulmuş bir harçiçin aktarın ve 10 ila 20 mililitre buz gibi soğuk ekstraksiyon tamponu ekleyin. Çekirdekleri tamamen öğütün, daha fazla ekstraksiyon tamponu ekleyin ve zemin dokusunu iki filtre bezi katmanı üzerinden filtreleyin.
10 dakika boyunca 8,000 kez G'de filtrasyon santrifüj edin. Sonra yeni bir tüp için supernatant aktarın ve filtrat atın. Tüpü 20,000 kez G'de 10 dakika santrifüj edin.
Supernatant dökün ve yıkama tampon altı mililitre pelet yeniden askıya alın. Aliquot beş 1.5 mililitre RNase-free tüpler içine süspansiyon ve santrifüj onları santrifüj 14, 000 kez G beş dakika. Supernatant atın ve sıvı azot içinde mitokondriyal pelet dondurun.
Üreticinin talimatlarına göre ticari reaktifler kullanarak mitokondriyal RNA ayıklayın ve bir RNA beş ana polifosfataz tedavi kurmak. Ardından, RNA'yı bir RNA temizleme kiti ile kurtarın. RNA ekstraksiyonu için kullanılan reaktif tehlikelidir.
Her zaman bir duman başlık onunla çalışmak ve her zaman laboratuvar önlüğü ve eldiven giymek. Beş prime polifosfataz tedavi ve tedavi edilmeyen mitokondriyal RNA aynı miktarda kullanarak iki daireselleştirme reaksiyonları hazırlayın. Her iki reaksiyonu da 16 derecede 12 ila 16 saat kuluçkaya yatırın ve daha önce kullanılmış bir RNA arıtma kiti ile kendi kendine bağlanan RNA'ları geri getirin.
26 SCRT ve yedi diğer ters transkripsiyon astarı eşit oranda bir astar karışımı hazırlayarak başlayın. El yazması talimatlara göre iki ters transkripsiyon reaksiyon sistemi bir araya getirin ve 50 dakika boyunca 42 derecede kuluçkaya yatırın. CDNA'yı normalleştirmek için, işlenmiş veya tedavi edilmeyen rna'lardan aynı cDNA hacmine sahip iki PCR reaksiyonu hazırlayın ve el yazmasında açıklanan termobisiklet koşullarında reaksiyonuyguluyoruz.
26S olgun rRNA ile normalleştirme birincil ve işlenmiş transkriptarasında ayrım yapmak için önemli bir adımdır. İki PCR ürününün bolluğunu karşılaştırın ve gerekirse şablon cDNA'ların miktarlarını ayarlayarak normalleştirmeyi optimize edin. Uygun hacimlerde normalleştirilmiş cDNA ve hedef transkriptlerin beş asal ile üç asal kavşaktaki gibi bir çift farklı astarla PCR reaksiyonları çiftleri hazırlayın ve el yazması yönlere göre PCR gerçekleştirin.
Daha sonra, iç içe PCR tarafından güçlendirilmiş belirgin bantları izole etmek için bir jel DNA kurtarma kiti kullanın. Standart teknikler kullanarak jel saflaştırılmış PCR ürünlerini bir vektöre klonlamak ve hedef ekler içeren pozitif klonlar seçmek için koloni PCR gerçekleştirmek. PCR ürünlerini sırala ve sıralama verilerini temel yerel hizalama arama aracını veya BLAST'ı kullanarak mısır mitokondriyal genomu ile hizala.
Organizma mısır ve arama veritabanı nükleotit toplama seçin. Dairesel transkriptin beş asal ile üç asal bağlantısını bulun ve beş asal ve üç asal transkript termini'nin konumlarını belirleyin. RNA sondasını hazırlamak için kullanılan DNA parçasını yükseltin ve daha önce kullanılan vektöre kopyalayın, bu vektörde bir T7 organizatörü, ekleme alanının yukarısında 17 baz çifti bulunur.
RNA problarını dig-11-UTP ile etiketlendirin ve ticari kitleri kullanarak RNA hibridizasyonunu gerçekleştirin. Normalleştirilmiş beş asal polifosfataz tedavi edilmiş ve tedavi edilmeyen RNA'lardan elde edilen dairesel RT-PCR ürünlerini karşılaştırarak birincil ve işlenmiş beş asal uçları ayırın. Ardından, haritalama sonuçlarına göre nicel RT-PCR astarları tasarlayın ve ayrımcılık sonuçlarını RT-PCR ile doğrulayın.
COX-2 geni, sirküler-PCR tabanlı strateji ile mısır mitokondriyal transkriptlerinin haritalandırılması ve ayrımcılığını göstermek için örnek olarak kullanılmıştır. Normalleştirilmiş cDNA'lar PCR için şablon olarak kullanıldı ve bu da beş ana polifosfataz tedavi örneğinden iki belirgin bantın güçlendirilmesiyle sonuçlandı. İki grup COX-2 bir ve iki jel kurtarıldı ve vektörler halinde klonlanmış seçildi.
Colony PCR sonuçları pozitif klonların değişken boyutuna sahip ekler içerdiğini gösterdi ve bu da termini'nin heterojen beş asal veya üç asal termini olduğunu ima etti. Sıralama sonuçları, COX-2 bir ve ikisinin dur kodonun 39 nükleotitinde aynı üç asal uça sahip olduğunu, beş prime termini'nin ise sırasıyla start codon'un yukarı sında 992'ye 1, 030 ve 1, 276'ya 1, 283 nükleotitte bulunduğunu göstermiştir. Dairesel RT-PCR haritalama sonuçlarını doğrulamak için RNA jel leke hibridizasyonu yapıldı ve COX-2 bir ve iki'ye benzer boyutlarda iki ana bant tespit edildi.
Farklı astarlar başka bir çift COX-2 üç ve dört bantları RNA jel leke ile tespit yükseltmek için tasarlanmıştır ama ilk kez dairesel RT-PCR ile değil. Kantitatif RT-PCR sonuçları COX-2 bir, iki, üç ve dört beş prime polifosfataz duyarlı olduğunu ve birincil beş prime termini olduğunu doğruladı. Bu protokole dahil edilmese de, beş asal eşleme sonuçlarını doğrulamak için astar uzantısı çözümlemesi yapılabilir.
