Questo protocollo viene utilizzato per la mappatura e la discriminazione delle trascrizioni primarie ed elaborate nei mitocondri di mais. Questa tecnica include una fase di normalizzazione dell'RNA e riduce al minimo l'influenza di cinque trifosfati primi instabili che ostacola una chiara discriminazione tra le trascrizioni primarie e elaborate. Oltre ai mitocondri di mais, questo metodo potrebbe essere applicato ai plastidi e ad altri mitocondri vegetali.
Inizia raccogliendo 20 grammi di noccioli in via di sviluppo in un tubo da 50 millilitri sul ghiaccio. Trasferire i chicchi in una malta pre-raffreddata e aggiungere da 10 a 20 millilitri di tampone di estrazione del freddo ghiacciato. Macinare completamente i chicchi, aggiungere più tampone di estrazione e filtrare il tessuto macinato attraverso due strati di panno filtrante.
Centrifugare il filtrato a 8.000 volte G per 10 minuti. Quindi trasferire il supernatante su un nuovo tubo e scartare il filtrato. Centrifugare il tubo a 20.000 volte G per 10 minuti.
Versare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in sei millilitri di tampone di lavaggio. Aliquota la sospensione in cinque tubi senza RNasi da 1,5 millilitri e centrifugali a 14.000 volte G per cinque minuti. Scartare il supernatante e congelare il pellet mitocondriale in azoto liquido.
Estrarre l'RNA mitocondriale utilizzando reagenti commerciali secondo le istruzioni del produttore e impostare un trattamento RNA cinque polifosfatatasi primaria. Quindi, recuperare l'RNA con un kit di purificazione dell'RNA. Il reagente utilizzato per l'estrazione dell'RNA è pericoloso.
Lavora sempre con esso in un cappuccio per fumi e indossa sempre camice da laboratorio e guanti. Preparare due reazioni di circolarizzazione usando le stesse quantità di cinque RNA mitocondriali trattati con polifosfatasi primaria e non trattati. Incubare entrambe le reazioni a 16 gradi celsius per 12-16 ore e quindi recuperare l'RNA auto-legato con un kit di purificazione dell'RNA precedentemente utilizzato.
Inizia preparando una miscela di primer con un rapporto uguale di 26 SCRT e fino ad altri sette primer di trascrizione inversa. Assemblare due sistemi di reazione di trascrizione inversa in base alle direzioni del manoscritto e incubarli a 42 gradi celsius per 50 minuti. Per normalizzare il cDNA, preparare due reazioni PCR con lo stesso volume di cDNA dei cinque RNA di polifosfatasi primaria trattati o non trattati ed eseguire la reazione in condizioni termocicliche descritte nel manoscritto.
La normalizzazione da parte dell'rRNA maturo 26S è un passaggio chiave per discriminare tra le trascrizioni primarie ed elaborate. Confrontare l'abbondanza dei due prodotti PCR e, se necessario, ottimizzare la normalizzazione regolando le quantità di cDNA modello. Preparare coppie di reazioni PCR con volumi appropriati di cDNA normalizzati e una coppia di primer divergenti come nella giunzione da cinque primi a tre primi delle trascrizioni bersaglio ed eseguire pcr secondo le direzioni del manoscritto.
Quindi, utilizzare un kit di recupero del DNA in gel per isolare le bande prominenti amplificate dalla PCR nidificata. Clonare i prodotti PCR purificati in gel in un vettore utilizzando tecniche standard ed eseguire la PCR colonia per selezionare cloni positivi contenenti gli inserti di destinazione. Sequenziare i prodotti PCR e allineare i dati di sequenziamento con il genoma mitocondriale del mais utilizzando lo strumento di ricerca di allineamento locale di base o BLAST.
Scegli il mais dell'organismo e cerca la raccolta nucleotidica del database. Trova la giunzione da cinque primi a tre primi della trascrizione circularizzata e determina le posizioni dei cinque termini di trascrizione primi e tre primi. Amplificare il frammento di DNA utilizzato per preparare la sonda RNA e clonarla nel vettore precedentemente utilizzato che contiene un promotore T7, 17 coppie di basi a monte del sito di inserimento.
Etichettare le sonde RNA con dig-11-UTP ed eseguire l'ibridazione dell'RNA utilizzando kit commerciali. Discriminare le cinque estremità principali primarie e lavorate confrontando i prodotti circolari RT-PCR ottenuti dai cinque RNA di polifosfatasi primaria trattati e non trattati normalizzati. Quindi, progettare primer RT-PCR quantitativi basati sui risultati della mappatura e verificare i risultati della discriminazione con RT-PCR.
Il gene COX-2 è stato usato come esempio per dimostrare la mappatura e la discriminazione delle trascrizioni mitocondriali di mais con la strategia circolare basata su RT-PCR. I cDNA normalizzati sono stati usati come modelli per PCR, il che ha portato a due bande prominenti amplificate dal campione trattato con polifosfatasi primaria. Le due bande sono state chiamate COX-2 una e due recuperate dal gel e clonate in vettori.
I risultati della PCR della colonia hanno mostrato che i cloni positivi contengono inserti con dimensioni variabili che implicano che i termini hanno eterogenei cinque primi o tre termini primi. I risultati del sequenziamento hanno mostrato che COX-2 uno e due hanno le stesse tre estremità prime a 39 nucleotidi a valle del codone di arresto mentre i loro cinque primi termini si trovano rispettivamente a 992 a 1,030 e 1, da 276 a 1.283 nucleotidi a monte del codone iniziale. L'ibridazione del gel RNA blot è stata eseguita per verificare i risultati della mappatura RT-PCR circolare e sono state rilevate due bande principali con dimensioni simili a COX-2 una e due.
Un'altra coppia di primer divergenti sono stati progettati per amplificare le tre e quattro bande COX-2 rilevate con la macchia di gel RNA ma non con la prima volta rt-PCR circolare. I risultati quantitativi rt-PCR confermarono che COX-2 uno, due, tre e quattro erano sensibili a cinque polifosfatasi primaria e che avevano cinque termini primi primari. L'analisi dell'estensione primer potrebbe essere eseguita per verificare i cinque risultati del mapping primario anche se non è inclusa in questo protocollo.
