הפרוטוקול המתואר כאן מודד את יעילות המקרופאג ריאות לאחר חשיפה לאוזון מזהם אוויר קריטריונים. נתונים אלה מצביעים על כך שחשיפה לאוזון מפחיתה את יעילות המקרופאזיס מכתב ולכן יכולה להיות מנגנון מדוע רמות גבוהות של אוזון מגבירות את השכיחות של מחלות ריאה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הערכת vivo של יעילות מקרופאג מכתש ללא כל מניפולציות לשעבר vivo של מקרופאגים שעשויים לשנות את הפנוטיפ או הפונקציה שלהם.
טכניקה זו חשפה מנגנון חדשני שבאמצעותו הריאה אינה יכולה לתקן את עצמה לאחר חשיפה לזיהום אוויר. בנוסף, טכניקה זו עשויה לחשוף מסלולים חדשניים למטרות לשנות את היעילות בריאה. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל מודל של פגיעה ריאות או דלקת.
עם זאת, המשתמש יצטרך לייעל כאשר עדיף להעריך את היעילות בעקבות פגיעה בריאות. ביצוע השאיפה oropharyngeal יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית. אני ממליץ לעבוד עם הצוות הווטרינרי שלך כדי לוודא שיש לך אופטימיזציה הטכניקה שלך לבצע הליך זה.
התחל על ידי culturing Jurkat T תאים בתרבות התאים הבסיסיים בינוני בתוספת על פי הוראות כתב היד ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. תאי Jurkat T הם קו תאים מתלים שניתן לשמור באמצעות מעבר למדיית culturing מחוממת מראש כל שלושה ימים. הכינו תאים אפטוטיים על ידי גידולם ל-90% קונפלונציה שלוקח שלושה עד ארבעה ימים לאחר המעבר.
לגדל תאים בחמישה בקבוקונים T75 כדי להשיג מספר מספיק של תאים עבור פרוטוקול זה. ברגע שהתאים מוכנים, שאפו את תכולת הבקבוק כ-24 מיליליטר והעבירו אותם לצינור חרוט של 50 מיליליטר. לספור את התאים באמצעות כתמים כחול טריפאן ו hemocytometer.
גלול את התאים על ידי צנטריפוגה ב 271 פעמים g במשך חמש דקות ולהשליך את העל טבעי. לאחר מכן, בצע שימוש חוזר בתאים במדיה כדי להשיג שלושה מיליון תאים למיליליטר. Aliquot התאים לתוך 100 על ידי 20 מילימטר רקמות תרבות מנות על ידי העברת חמישה מיליליטר של תאים לכל צלחת.
הכינו כתשע מנות תרבות. מניחים מנה אחת בצד כשליטה שלא תחשוף וחושפים את שאר הכלים לקרינת UV. הגדר את UV crosslinker לרמת האנרגיה הנכונה על ידי לחיצה על כפתור האנרגיה והזנת 600 עם לוח המספרים. הקרין את כל הכלים עם התאים למעט הפקד הקפדה להסיר את הכיסוי העליון של צלחת תרבות הרקמה במהלך חשיפה UV.
לאחר מכן, להחרים את כל הכלים באינקובטור תרבות התא ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך ארבע שעות. לאחר הדגירה, לשלב את כל התאים מוקרן לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר גלולה אותם על ידי צנטריפוגה ב 271 פעמים g במשך חמש דקות. השליכו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את התאים ב-24 מיליליטר של PBS סטרילי.
צנטריפוגה הצינור שוב ולהסיר את supernatant. הכן את התאים עבור עכברים מנודים על ידי שימוש חוזר בהם PBS בריכוז המתאים. לאחר שהעכבר הרדים כראוי, מקם אותו בתמקם על-חושי למחצה.
השתמש בחוט כירורגי קשור בין יתדות על לוח גיליון אקרילי מלוכלך כדי להשעות את העכבר על ידי החותכים maxillary. השתמש בזוג מלקחיים קהים שאינם מפוספסים כדי לתפוס ולמשוך קלות את לשון העכבר ולהחדיר את התאים apoptotic לתוך חלל הפה עם פיפטה P200. מינון הוא מוצלח כאשר עכברים לעשות רעש פיצוח אחת עד שתי שניות לאחר קבלת המינון.
באצבע כפפה, מכסים בעדינות את אפו של העכבר עד שהוא שואף בזמן שהלשון נסוגה. שמור על האף מכוסה עד שאין נוזל גלוי בחלל הפה והעכבר לקח שתי שאפים או יותר. הסר את העכבר מלוח החיסון והחזר אותו לכלוב כדי לאפשר לו להתאושש מהרדמה הקפדה למקם את העכבר על גבו כדי למנוע פסולת לחסום את nares.
לאחר שכל העכברים התעוררו מהרדמה, המתינו 90 דקות כדי לאפשר למאקרופגים מכתים להציף זרם של תאים אפופטיים. כדי לאסוף נוזל טבליות, הכינו את העכבר המתת חום בהתאם לכיווני כתב היד. לאט לדחוף PBS לתוך הריאות המאפשר להם לנפח, ואז למשוך את אותו נפח בחזרה החוצה לוודא PBS אינו יוצא הנחיריים.
לאסוף את lavage בריכה מכל עכבר בצינור 15 מיליליטר. צנטריפוגה lavage bronchoalveolar או BAL ב 610 פעמים g במשך שש דקות בארבע מעלות צלזיוס, לאסוף את supernatant לתוך צינור 1.5 מיליליטר, ולהקפיא אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס. גלולה מייצג את התאים מהחלל bronchoalveolar.
הוסף מיליליטר אחד של חיץ תות תות דם אדום ACK לכדור כדי להסיר את תאי הדם האדומים שיורית. Vortex ו lyse במשך דקה אחת על קרח, ולאחר מכן להוסיף ארבעה מיליליטר של PBS כדי לעצור את תגובת ת ליסיס. צנטריפוגה התאים ב 610 פעמים g במשך שש דקות בארבע מעלות צלזיוס ולשאוב את העל עם שאף ואקום.
לאחר מכן, בצע שימוש חוזר בתאים במיליליטר אחד של PBS עם 10%FBS וספירת התאים על המוציטמטר ללא טריפאן בלו. צנטריפוגה 120 מיקרוליטרים של כל מדגם על שקופיות ב 12 פעמים g במשך שלוש דקות באמצעות תאוצה בינונית ציטוצנטריפוגה. השאירו את המגלשות להתייבש בן לילה.
למחרת, להכתים את השקופיות עם hematoxylin ו eosin על מנת לחשב הן ספירת תאים יעילות דיפרנציאלי. לאחר מכן, הצג שקופיות תחת הגדרת Brightfield במיקרוסקופ ביולוגי באמצעות מטרה של פי 20 או 40. לחשב את האינדקס efferocytic בהתבסס על היחס של מקרופאגים מכתים כי phagocytosed תאי Jurkat T apoptotic כדי מקרופאגים מכתרים ללא ספיגת תא apoptotic לוודא לספור לפחות 200 תאים מכל שקופית.
פרוטוקול זה שימש כדי לחקור את ההשפעה של חשיפה לאוזון על דלקת ריאות. עכברים חשופים באוזון הציגו עלייה במקרופאגים ונויטרופילים במרחב האוויר בהשוואה לקבוצת בקרת האוויר המסוננת והיתה להם עלייה בחלבון BAL, סמן של תפקוד אפיתל מכתריים. לפני מיום העכברים, אפופטוזיס בתאי Jurkat T אושרה עם ציטומטריית זרימה.
רמת החשיפה של 60 מילי joule UV ותקופת הדגירה של ארבע שעות גרמו לתוצאות חוזרות ונשנות של כ -75% תאים אפטופטיים. מקרופאגים פרוצטיים זוהו כמאקרופאגים שבלע תא Jurkat T בהשוואה למאקרופאגים מים רגילים. חלה ירידה משמעותית במדד היעילות של הקבוצה החשופה לאוזון בהשוואה לפקדי האוויר המסוננים המצביעים על כך שדלקת ריאות הנגרמת על ידי האוזון קשורה לירידה בסיווג של תאים אפופטיים.
תשומת לב לפרטים וכתיבת כל ההבדלים שנצפו היא קריטית במהלך הליך זה. מומלץ גם לעוור את הדגימות לניתוח ויש לי שני אנשים שונים לספור את מקרופאגים. לאחר הבידוד, ניתן להשתמש בתאי BAL לניתוח mRNA, מוכתמים עבור סמנים נוספים על ידי immunofluorescence, ו / או לרוץ על ציטומטר זרימה כדי להבחין בשינויים פנוטיפיים.
