שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חסינות ריאות על איך להעריך את הביטוי של microRNAs כי הם צפויים לווסת גנים דלקתיים בתוך הריאה. טכניקה זו מציעה את הדרך הפשוטה לזיהוי התרומות של הורמונים במחזור ביטוי microRNA ריאות. כדי להעריך את שלב מחזור estrous, לרסן באופן ידני עכבר נקבה בן שמונה עד תשעה שבועות ולהציג את הקצה של פיפטה פלסטיק 10 מיקרוליטר מלא מים טהורים במיוחד לתוך הנרתיק.
יש לשטוף בעדינות ארבע עד חמש פעמים כדי לאסוף דגימה, ולהפקיד את הסומק הסופי של נוזל הנרתיק על מגלשת זכוכית. לאחר מכן התבונן סומק הנרתיק מוכתם תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה 20X. לחשיפות לאוזון ואוויר מסונן, מניחים עד ארבעה עכברים באחד משני מיכלי זכוכית בודדים באורך 1.2 ליטר עם מכסי רשת תיל.
שים מיכל זכוכית אחד בתא אוזון ואחד בתא חשיפה לאוויר מסונן. לאחר מכן להתאים את ריכוז האוזון לשני חלקים למיליון, הסרת המיכל לאחר שלוש שעות. ארבע שעות לאחר החשיפה, לחטא את פני העור החשופים של העכבר הניסיוני הראשון עם 70% אתנול לחתוך את כלוב הצלעות כדי לחשוף את הלב והריאות.
השתמש מדפים כדי לטבול 1.5 מיליליטר RNase ללא צינור מיקרו צנטריפוגה בחנקן הנוזלי, ו הצמד להקפיא את הריאה שנקטפה בחנקן הנוזלי. לאחר מכן השתמש pulverizer רקמת נירוסטה כדי mascerate את הריאה כולה, ולפצל את הרקמה מרוסקת בין שני צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר. לאחר קצירת ומרסק את הריאות מכל בעלי החיים באותו אופן, להוסיף 500 microliters של guanidinium thiocyanate לכל מדגם ברצף הומוגניזציה כל רקמה עם 18, 21, ו 23 מחטי מד.
לאחר ההומוגניזציה האחרונה, מוסיפים 500 מיקרוליטרים של אתנול לכל דגימה לפני המערבולת במשך 15 שניות. טוענים את תערובות לתוך עמודי ספין בודדים בצינורות איסוף בודדים עבור צנטריפוגה להשליך את flowthroughs. לטיפול DNase 1, להוסיף 400 microliters של מאגר לשטוף RNA לכל עמודה עבור צנטריפוגה אחרת לערבב חמישה microliters של DNase 1 ו 75 microliters של מאגר עיכול DNA לכל מדגם צינורות RNase חינם.
מוסיפים את התערובת ישירות למטריצה הטורית עבור דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר, ואחריה שתי 400 תותחי RNA מיקרוליטר שטיפת מראש על ידי צנטריפוגה. כדי לחמק מה-RNA, הוסיפו 35 מיקרוליטרים של מים נטולי DNase RNase ישירות לכל מטריצת עמודה לצנטריפוגה סופית, ולמדוד את הריכוז והטוהר הכוללים של ה-RNA של כל דגימה על ספקטרופוטומטר. לאחר מכן לאחסן את RNA במינוס 80 מעלות צלזיוס.
לקבלת retrotranscription של RNase קטן, להוסיף 200 ננוגרם של RNA הכולל ב 10 microliters של פתרון prewash לצינור אחד של תערובת תגובת שעתוק הפוך לכל מדגם. לאחר ערבוב, לזמן קצר צנטריפוגה הדגימות מניחים אותם על קרח עד הדגירה שלהם. לאחר מכן, הדגירה את הצינורות במשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ואחריו דגירה של חמש דקות ב 95 מעלות צלזיוס.
בסוף הדגירה השנייה, לדלל את CDNA עם 200 microliters של מים ללא RNase לכל 20 תגובת שעתוק הפוך microliter, ולהוסיף 10 microliters של כל מדגם תערובת תגובה לכל באר של תגובה דלקתית עכבר טעון מראש מערך PCR microRNA אוטואימוניות. שלב proestrus יכול להיות מזוהה על ידי נוכחות של תאים אפיתל מעוגל מעוצב היטב. כאשר העכבר נמצא בשלב האסטרוס, אשכולות צפופים של תאי אפיתל משונכים, משופצים ומצווחניים נצפו במריחה.
במהלך מטסטרוס, תאי אפיתל קורנווליים ולוקוציטים פולימורפונוקלאר נראים. ב diestrus, לויוציטים הם בדרך כלל נפוצים יותר. RNA המופק מארבע ריאות עכבר, כפי שהוכח, מציג ריכוזי חומצות גרעין הנעים בין 1198 ל-2178 ננוגרם למיקרוליטר ויחס ממוצע של A260 ל-A280 בין 2.01 ל-2.02, ויחס ממוצע בין A260 ל-A230 בין 2.139 ל-2.223.
בטבלה זו מוצגים שינויים כפולים בביטוי microRNA בין האוזון לעכברים חשופי אוויר מסוננים. לאחר מסנן יעד microRNA וניתוח ליבה עבור 14 microRNAs, כדי לקבל את יחס יומן הביטוי המשמעותי וערכי P, נתונים אלה יכולים להיות ממופים על ידי מסנן היעד microRNA. ניתוח הליבה מספק גם מידע על מסלולים קנוניים, מחלות ותפקוד, רגולטורים ורשתות.
כמו כן, ניתן להשתמש בתוכנת הניתוח הפונקציונלית כדי לייצר ניתוח רשת המציג את הקשר בין microRNAs של עניין ומולקולות אחרות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לבדוק את מחזור estrus מדי יום לפחות שלושה מחזורים רצופים לפני ביצוע ניסוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כדי לענות על שאלות נוספות על ביטוי גנים דלקתיים ריאות לאורך מחזור estrus.
לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים אחרים בתחום חסינות הריאות לחקור מנגנונים של ויסות הורמון המין באמצעות מודלים אחרים.
