此处描述的协议测量了接触标准空气污染物臭氧后肺巨噬细胞功能。这些数据表明，臭氧暴露可减少肺动脉巨噬细胞增多，从而成为臭氧水平升高增加肺部疾病发病率的一个机制。这项技术的主要优点是，它允许在体内评估肺功能巨噬细胞功能，而无需对巨噬细胞进行任何可能改变其表型或功能的外体操作。
这项技术揭示了一种新的机制，即肺部在空气污染暴露后无法自我修复。此外，这项技术可能揭示出改变肺部肺功能瘤靶点的新途径。此方法可应用于任何肺损伤或炎症模型。
然而，当用户最好评估肺损伤后肺功能瘤时，用户将需要进行优化。执行咽咽吸入可能在技术上具有挑战性。我建议与你的兽医工作人员合作，以确保你优化了你的技术，以执行这个程序。
首先在基底细胞培养基细胞中培养Jurkat T细胞，根据37摄氏度和5%的二氧化碳的手稿方向进行补充。Jurkat T细胞是一种悬浮细胞系，每三天通过传递到预热培养介质来保持。通过将细胞生长到90%的汇合，在经过三到四天后，准备凋亡细胞。
在五个T75烧瓶中生长细胞，以获得足够数量的细胞用于此协议。一旦细胞准备好，吸气的烧瓶内容约24毫升，并转移到50毫升锥形管。使用 Trypan 蓝色染色和血细胞计计算细胞。
以271次g离心将细胞挖碎5分钟，然后丢弃上经剂。然后，在介质中重新发送细胞，每毫升获得300万个细胞。通过每盘转移5毫升细胞，将细胞分成100至20毫米组织培养皿。
准备大约九道文化菜肴。将一盘放在一边作为未暴露的控件，将剩余的盘子暴露在紫外线下。按下能量按钮，用数字垫输入 600，将 UV 交联器设置为正确的能量水平。用细胞照射所有盘子，但控制除外，确保在紫外线照射期间去除组织培养皿的顶盖。
然后，在37摄氏度的细胞培养箱中孵育所有菜肴，在4小时内孵育5%的二氧化碳。孵育后，将所有辐照细胞组合成50毫升锥形管，以271倍g的离心进行5分钟。丢弃上一液，将细胞重新在24毫升的无菌PBS中。
再次离心管并取出上一代。在适当的浓度下，在PBS中重新为小鼠重新注射，为给小鼠做给的细胞做好准备。一旦鼠标被正确麻醉，就把它放在一个半卧化的超生位置。
使用手术串绑在倾斜的丙烯酸板上的挂钩，以悬挂鼠标的最大切口。使用一对钝的非脊钳轻轻抓住并拉扯小鼠舌头，用P200移液器将凋亡细胞注入口腔。当小鼠在接受剂量后一到两秒钟发出噼啪声时，剂量是成功的。
用戴手套的手指轻轻盖住鼠标的鼻子，直到它在舌头缩回时吸气。保持鼻子覆盖，直到口腔中看不到液体，小鼠已经吸入了两次或两次。将鼠标从接种板上取出，并返回到笼中，使其从麻醉中恢复，确保将鼠标放在其背上，以防止碎屑阻塞内子。
所有的小鼠都从麻醉中醒来后，等待90分钟，让道利巨噬细胞吞没凋亡细胞的涌入。要收集熔岩流体，请根据手稿指示准备安乐死小鼠。慢慢地将 PBS 推入肺部，让其充气，然后将相同的体积拉回，确保 PBS 不会从鼻孔中退出。
在15毫升的管子中收集每只老鼠的池状熔岩。将支气管或BAL以610倍g离心，在4摄氏度下6分钟，将上经液收集到1.5毫升管中，并在零下80摄氏度时冻结。颗粒代表来自支气管空间的细胞。
在颗粒中加入一毫升的 ACK 红细胞解液缓冲液，以去除残留的红血球。漩涡和乳糖在冰上停留一分钟，然后加入四毫升PBS，以阻止解笑反应。在4摄氏度下以610倍g离心，6分钟，用真空吸尘器吸最后一代。
然后，用10%FBS将细胞重新用10%FBS在PBS的一毫升中重新发送，并在没有 Trypan Blue 的血细胞计上计算细胞。使用中等加速度和细胞离质，以12倍g将每个样品的120微升离心机以12倍g的速度将120微升推至幻灯片上，3分钟。将幻灯片晾干过夜。
第二天，用赤氧树脂素和 eosin 染色幻灯片，以计算血性细胞和差分细胞计数。然后，使用 20 倍或 40 倍的视镜在生物显微镜上的 Brightfield 设置下查看幻灯片。计算有效指数基于噬菌体巨噬细胞的比例，噬菌体细胞与道拉巨噬细胞没有凋亡细胞吸收，确保从每张幻灯片中计算至少200个细胞。
该协议用于研究臭氧暴露对肺部炎症的影响。与过滤的空气对照组相比，臭氧暴露的小鼠在空气空间中显示巨噬细胞和嗜中性粒细胞增加，并且有BAL蛋白的增加，而BAL蛋白是道膜上皮功能障碍的标记。在给小鼠做点分之前，用流式细胞学确认了Jurkat T细胞的凋亡。
60毫焦耳紫外线照射水平和4小时的孵育时间导致约75%凋亡细胞的重复结果。与常规的道利巨噬细胞相比，埃夫罗细胞巨噬细胞被确定为吞没了Jurkat T细胞的巨噬细胞。与过滤的空气控制相比，臭氧暴露组的空气细胞指数显著下降，这表明臭氧诱发的肺炎症与凋亡细胞的间隙减少有关。
在此过程中，注意细节并写下任何观察到的差异至关重要。也建议对样品进行盲目分析，让两个不同的人计算巨噬细胞。分离后，BAL细胞可用于mRNA分析，通过免疫荧光染色为其他标记，和/或在流动细胞仪上运行，以区分表值变化。
