Il protocollo qui descritto misura l'efferocitosi dei macrofagi polmonari dopo l'esposizione a criteri di ozono inquinante nell'aria. Questi dati indicano che l'esposizione all'ozono diminuisce l'efferocitosi macrofagia alveolare e potrebbe quindi essere un meccanismo per cui elevati livelli di ozono aumentano l'incidenza delle malattie polmonari. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente una valutazione in vivo dell'efferocitosi macrofagia alveolare senza alcuna manipolazione ex vivo dei macrofagi che può alterare il loro fenotipo o funzione.
Questa tecnica ha rivelato un nuovo meccanismo con cui il polmone non può ripararsi dopo l'esposizione all'inquinamento atmosferico. Inoltre, questa tecnica può rivelare nuove vie verso bersagli che alterano l'efferocitosi nel polmone. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi modello di lesione polmonare o infiammazione.
Tuttavia, l'utente dovrà ottimizzare quando è meglio valutare l'efferocitosi dopo la lesione polmonare. Eseguire l'aspirazione orofaringea può essere tecnicamente impegnativo. Consiglierei di lavorare con il tuo personale veterinario per assicurarti di aver ottimizzato la tua tecnica per eseguire questa procedura.
Inizia coltivando cellule Jurkat T in un mezzo di coltura cellulare basale integrato secondo le direzioni del manoscritto a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Le celle Jurkat T sono una linea cellulare a sospensione che può essere mantenuta attraverso la passatura in mezzi di coltivazione pre-riscaldati ogni tre giorni. Preparare le cellule apoptotiche facendole crescere al 90% di confluenza che richiede da tre a quattro giorni dopo la passaging.
Far crescere le cellule in cinque contenitori T75 per ottenere un numero sufficiente di celle per questo protocollo. Una volta che le cellule sono pronte, aspirare il contenuto del pallone di circa 24 millilitri e trasferirli in un tubo conico da 50 millilitri. Contare le cellule usando la colorazione Trypan Blue e un emocitometro.
Pellettare le cellule per centrifugazione a 271 volte g per cinque minuti e scartare il supernatante. Quindi, rimospendare le cellule nei media per ottenere tre milioni di cellule per millilitro. Aliquota le cellule in piatti di coltura tissutale da 100 per 20 millimetri trasferendo cinque millilitri di cellule per piatto.
Preparare circa nove piatti della cultura. Mettere da parte un piatto come controllo non esposto ed esporre i piatti rimanenti ai raggi UV. Impostare il retino UV al livello di energia corretto premendo il pulsante energia e inserendo 600 con la tastiera numerica. Irradiare tutti i piatti con le cellule ad eccezione del controllo assicurandosi di rimuovere la copertura superiore del piatto di coltura tissutale durante l'esposizione ai raggi UV.
Quindi, incubare tutti i piatti in un incubatore di coltura cellulare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per quattro ore. Dopo l'incubazione, unire tutte le cellule irradiate in un tubo conico da 50 millilitri e pelletarle per centrifugazione a 271 volte g per cinque minuti. Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in 24 millilitri di PBS sterile.
Centrifugare di nuovo il tubo e rimuovere il supernatante. Preparare le cellule per il dosamento dei topi riutilizzandoli in PBS alla concentrazione appropriata. Una volta che il mouse è correttamente anestetizzato, posizionarlo in una posizione supina semi-reclinata.
Utilizzare una corda chirurgica legata tra pioli su un foglio di acrilico inclinato per sospendere il mouse dagli incisivi mascellari. Utilizzare un paio di pini smussati non increspati per afferrare e tirare leggermente la lingua del topo e infondere le cellule apoptotiche nella cavità orale con una pipetta P200. Il dosing ha successo quando i topi fanno un rumore scoppiettante da uno a due secondi dopo aver ricevuto la dose.
Con un dito guantato, coprire delicatamente il naso del topo fino a quando non inala mentre la lingua è retratti. Tenere il naso coperto fino a quando non è visibile alcun liquido nella cavità orale e il mouse ha assunto due o più inalazioni. Rimuovere il mouse dalla tavola di inoculazione e restituirlo alla gabbia per consentirgli di riprendersi dall'anestesia assicurandosi di posizionare il mouse sulla schiena per evitare che i detriti blocchino i nares.
Dopo che tutti i topi si sono svegliati dall'anestesia, attendere 90 minuti per consentire ai macrofagi alveolari di inghiottire l'afflusso di cellule apoptotiche. Per raccogliere il liquido di lavanda, preparare il topo eutanasiato secondo le indicazioni del manoscritto. Spingere lentamente pbs nei polmoni permettendo loro di gonfiarsi, quindi tirare indietro lo stesso volume assicurandosi che il PBS non esevolva dalle narici.
Raccogliere la lavanda in piscina da ogni topo in un tubo da 15 millilitri. Centrifugare il lavaggio broncoalveolare o BAL a 610 volte g per sei minuti a quattro gradi Celsius, raccogliere il supernatante in un tubo da 1,5 millilitri e congelarlo a meno 80 gradi Celsius. Il pellet rappresenta le cellule dello spazio broncoalveolare.
Aggiungere un millilitro di tampone dilisi dei globuli rossi ACK al pellet per rimuovere i globuli rossi residui. Vortice e liscivie per un minuto sul ghiaccio, quindi aggiungere quattro millilitri di PBS per fermare la reazione di lisi. Centrifugare le cellule a 610 volte g per sei minuti a quattro gradi Celsius e aspirare il supernatante con un aspiratore sottovuoto.
Quindi, rimescolare le cellule in un millilitro di PBS con 10%FBS e contare le cellule su un emocitometro senza Trypan Blue. Centrifuga 120 microlitri di ogni campione su scivoli a 12 volte g per tre minuti utilizzando un'accelerazione media e un citocentrifugo. Lasciare asciugare gli scivoli durante la notte.
Il giorno dopo, macchiare le diapositive con ematossilina ed eosina per calcolare sia il numero di cellule efferocitiche che differenziali. Quindi, visualizza le diapositive sotto un'impostazione Brightfield su un microscopio biologico utilizzando un obiettivo 20X o 40X. Calcolare l'indice efferocitico in base al rapporto tra macrofagi alveolari che hanno fagocitosto cellule Jurkat T apoptotiche a macrofagi alveolari senza assorbimento di cellule apoptotiche assicurandosi di contare almeno 200 cellule da ogni diapositiva.
Questo protocollo è stato utilizzato per studiare l'effetto dell'esposizione all'ozono sull'infiammazione polmonare. I topi esposti all'ozono hanno mostrato un aumento dei macrofagi e dei neutrofili nello spazio aereo rispetto al gruppo di controllo dell'aria filtrato e hanno avuto un aumento della proteina BAL, un marcatore della disfunzione epiteliale alveolare. Prima di dosare i topi, l'apoptosi nelle cellule T di Jurkat è stata confermata con citometria a flusso.
Il livello di esposizione ai raggi UV di 60 milli joule e il tempo di incubazione di quattro ore hanno portato a risultati ripetitivi di circa il 75% di cellule apoptotiche. I macrofagi efferocitici sono stati identificati come macrofagi che avevano inghiottito una cellula Jurkat T rispetto ai normali macrofagi alveolari. L'indice efferocitico del gruppo esposto all'ozono è diminuito in modo significativo rispetto ai controlli dell'aria filtrati, il che indica che l'infiammazione polmonare indotta dall'ozono è associata a una diminuzione della clearance delle cellule apoptotiche.
L'attenzione ai dettagli e la scrittura di eventuali differenze osservate è fondamentale durante questa procedura. Si consiglia inoltre di accecare i campioni per l'analisi e fare in modo che due persone diverse contino i macrofagi. Dopo l'isolamento, le cellule BAL possono essere utilizzate per l'analisi dell'mRNA, macchiate per marcatori aggiuntivi per immunofluorescenza e /o eseguite su un citometro a flusso per distinguere i cambiamenti fenotipiche.
