בניגוד לאורגניזמים אירוביים, מיקרואורגניזמים אנאירוביים לחלוטין דורשים היעדר חמצן. מכיוון שחמצן נמצא בכל מקום באוויר, שמירה על תנאים נטולי חמצן במהלך הטיפוח היא דרישה מוקדמת לטיפוח אנאירובי. הטכניקה המיושמת מייצגת שיטה פשוטה וזולה לספק תנאים אנוקסיים לטפח אוכלוסייה מיקרוביאלית מעורבת בתרבות הנוזלית.
טכניקה זו יכולה להיות מיושמת גם לטיפוח תרבויות טהורות. עם זאת, עבור מיקרואורגניזמים רגישים לחמצן מאוד, הליך זה עשוי שלא להיות ישים. התחל על ידי שקילה של מרכיבים בינוניים בבקבוקון מתאים, והמסתם עם חצי נפח של מים מזוקקים.
לאחר מכן, להוסיף מיליליטר של מחוון REDOX, ואחריו ויטמינים בפתרון אלמנט קורט. כוונן את ה- pH בהתאם לדרישות האורגניזם, וה להביא את הנפח הסופי ל 1 ליטר עם מים מזוקקים. הצבע של מחוון REDOX תלוי ב- pH, וייתכן שיהיה לו זמן להתאים אותו.
ממלאים 120 בקבוקי סרום מיליליטר עם 50 מיליליטר של מדיום, ולאחר מכן דגירה אותם באמבט מים 100 מעלות צלזיוס במשך 20 עד 30 דקות, כדי להפחית את מבודדות החמצן בשלב הנוזלי. לשטוף את מרחב הראש עם חנקן. לטפל אוורור החדר המתאים בעת עבודה עם חנקן.
סוגרים את הבקבוקים עם ספטה גומי בוטיל, ולתקן את כובעי אלומיניום. לאחר מכן, הוסף 0.1 מיליליטר של הפחתת סוכן לכל בקבוקון, כדי להפחית עוד יותר את פוטנציאל REDOX. ו autoclave את flasks במשך 20 דקות ב 121 מעלות צלזיוס.
יש להשתמש במקלטה אוטומטית המאושרת לערקור כלי שיט סגורים בעת החלת פרוטוקול זה. אחרת, לחץ יתר הנגזר מעליית הטמפרטורה עלול לגרום לבקבוקי סרום להתפוצץ. כדי להכין inoculum מעכל אנאירובי, להוסיף 400 מיליליטר של מים מזוקקים לבקבוק ולהביא אותו לרתיחה.
מצננים אותו לכ-30 מעלות צלזיוס תוך שטיפה קבועה של חלל הראש בחנקן. מוסיפים כ -100 גרם של בוצה, נגזר מעכל אנאירובי, הקפדה על רשומות המסה המדויקת של הבוצה לקביעת דילול. החלף את חלל הראש של הבקבוק עם חנקן, וסגור אותו עם מחיצת גומי בוטיל.
לנער את הבקבוק במשך 30 דקות ב 120 סל"ד. תן חלקיקי בוצה גדולים יותר מים, ולאחר מכן להשתמש מזרק וקנולה כדי להסיר 5 מיליליטר של inoculum ולהזריק אותו לתוך בקבוק נסיוב מוכן בעבר. הדגירה את בקבוק הסרום מחוסן בטמפרטורה המתאימה לניסוי, הקפד לנקז את הלחץ יתר שנגרם על ידי עליית הטמפרטורה, כ 15 עד 30 דקות לאחר תחילת הדגירה.
כדי להעריך את ייצור והרכב הגז הביולוגי בזמן הדגירה, להקליט את הלחץ האטמוספרי הנוכחי ולהכין מד חום כדי להעריך את הלחץ בתוך הבקבוק. לנער את flasks ולהסיר 1 מיליליטר של גז חלל הראש באמצעות המזרק ואת canula. למדוד את מימן, חמצן, מתאן, וריכוז פחמן דו חמצני באמצעות כרומטוגרפיה גז.
השתמש 1 מיליליטר של נוזל מן הבקבוק כדי לפקח על הריכוזים של כל חומצות שומן גבוהות, על פי הוראות כתב היד, ולנקז את flasks מעל הלחץ לאחר החזרתו לטמפרטורה המתאימה. פרוטוקול זה שימש ליצירת ביו-חומרים מיניאטוריים המבצעים עיכול אנאירובי. טריפטופן, טירוסין, פנילאלנין, תמצית בשר, קזין נוספו ב 3 ריכוזים שונים, וייצור מתאן היה במעקב על פני תקופת דגירה 28 יום.
מתנוגנים הוצגו על ידי הקרנת האנזים השותף F420, שהוא נושא אלקטרונים במתנוגנזה, ומפגין פלואורסצנטיות כחולה-ירוקה עם ספיגה מקסימלית של 420 ננומטר. במקביל לניתוח גז, נותחו דגימות עבור חומצת שומן נדיפת, וריכוזי חומצת פניל במהלך תקופת הדגירה. ניתן ליישם שיטות ביולוגיות מולקולריות המכוונות לשפע של מיקרואורגניזמים ו/או הרכב של הקהילה המיקרוביאלית, בשלב מסוים של הניסוי, באמצעות ההליך המתואר.
