פרוטוקול זה מספק גישה חדשה לכימות דינמיקת הענפים של הארבור הדנדריטי ופיתוח נוירונים באמצעות הדמיה בזמן אמת ותופס ביאור תמונה תלת-ממדית. טכניקה זו מדמה ומעקב אחר מסופי הענף ומספקת שיטה מהירה ויעילה למדידת ההתנהגויות הדינמיות של פילופודיה דנדריטית. מחקר בשיטה זו מספק תובנה להבנת האופן שבו פיתוח ופעילות מווסתים את מורפוגנזה דנדריט.
השיטות שלנו ישימות לנוירונים המסווים בדלילות הן בהגדרות הפריה והן בהגדרות ה-vivo. בעת ביצוע הליך זה, זכור כי יש להתאים את פרמטרי ההדמיה בקפידה כדי להשיג רזולוציה זמנית ומחזורית מספקת. כדי לקצור מוחות מדרוסופילה זחל, תחת מיקרוסקופ מנתח להשתמש בזוג אחד של מלקחיים ניתוח קצה סטנדרטי מספר חמש להחזיק דגימת זחל במקום תוך שימוש השני כדי לנתח בזהירות את המוח, שמירה על דיסקיות העין, אונות המוח, ואת חוט העצב הגחוני.
לאחר מכן להסיר את השרירים המצורפים כדי למזער כל תנועה של המדגם במהלך הדמיה. כאשר כל המוחות נקצרו, השתמש בשומן ואקום כדי לצייר תא מרובע על מגלשת זכוכית ולהוסיף 20 מיקרוליטרים של תמיסת מלח חיצונית לתא. השתמש במקלפים כדי להעביר את המוח לתא ולהתאים את תנוחות המוח מתחת למיקרוסקופ כאשר הצדדים הגביים פונים כלפי מעלה.
מכסים את התא עם להחליק כיסוי זכוכית ולחץ בעדינות על החלקת הכיסוי כדי להפחית את הדגימה נסחף במהלך הליך ההדמיה. כדי לזהות מפלי מוח המכילים נוירונים המסומן בנפרד, בתוך 30 דקות מהניתוח בחר מטרת טבילת מים פי 40 ומקור אור אפיפלואורסצנטי. בחר לייזר פוטון שני מכוון 920 ננומטר גלאי שאינו Dscan ולהגדיר את הפרמטרים הדמיה כדי לאסוף את התמונות ב 512 על ידי 512 פיקסלים לכל מסגרת ודקה אחת לכל מחסנית Z במשך 10 דקות.
לאחר מכן, התאימו את הזום האופטי והדיגיטלי כדי להשיג רזולוציית X, Y, Z מספקת תוך הקפדה על הכיסוי של כל האילנות הדנדריטית תוך דקה אחת. ההגדרות ייצרו תמונות ברזולוציית X, Y, Z טיפוסית של 0.11 על 0.11 על 0.25 מיקרומטר. לתיקון להיסחף, לפתוח את הקובץ של עניין בתוכנית תיקון להיסחף מתאים ולחץ על עריכה ועריכה של פרמטרים מיקרוסקופיים.
הגדר את סוג המיקרוסקופ לשדה רחב עבור שתי תמונות הפוטון אם קיימת אפשרות של שני פוטון ועקוב אחר זרימת העבודה שהוגדרה על-ידי התוכנה. עבור deconvolution, לפתוח את התמונה לתקן להיסחף בתוכנת deconvolution ופעל זרימת העבודה. לאחר מכן, שמרו את התמונה המפותלת בסוג קובץ הנתמך על-ידי תוכנת ביאור התמונה הבאה המסוגלת לנתח נתוני 4D ולדווח על הקואורדינטות המרחביות של נקודות מוגדרות בתוך התמונה.
לביאור תמונה, פתחו את התמונה המפותלת בתוכנת ביאור התמונה ובדקו וסמן את קצות הענף בכל נקודות הזמן ב-3D. תוכנת ביאור התמונה תדווח ותאמחסן את הקואורדינטות המרחביות והתזהיות של קצות הענף המסומנים. יצא את מידע הקואורדינטות כקובץ CSV לחישובים הבאים.
במודול כתמים, לחץ על דלג על יצירה אוטומטית, ערוך באופן ידני וסמן את תיבת הסימון התחבר אוטומטית לספוט שנבחר. סקור את המסגרות בסדרת הזמנים ובחר ענף לביאור. החזקת מקש Shift לחוץ, לחץ על קצה מסוף הענף כדי להוסיף נקודה.
לאחר מכן, לחץ על הכרטיסיה סטטיסטיקה, בחר מפורט, ערכים ספציפיים ומיקום. המידע המתועד של קואורדינטות מרחביות וזמן יוצג. לחץ על שמור כדי לייצא את הנתונים כקובץ CSV.
לחישוב מיקום תיאור הענף ב- 3D, פתחו את קובץ ה- CSV כגיליון אלקטרוני ובחרו בעמודה 'מזהה רצועה'. לחץ על מיין מהקטן ביותר לגדול ביותר וקבל את הרחבת הבחירה. לאחר המיון, מזהה רצועה יזהה כל ענף דנדריטי ייחודי והנקודות מאותו ענף חולקות את אותו מזהה רצועה.העמודה שעה תחסן את המידע ממסגרות זמן שונות.
בגיליון האלקטרוני, הוסף עמודת מרחק ולהשתמש בקואורדינטות כדי לחשב את המרחק של כל שתי נקודות סמוכות זמנית. כדי למדוד תנועות משניות ברמת voxel בודדת, אפס את כל ערכי המרחק הקטנים מ- 0.3 מיקרומטר כדי לסנן כל ביאור תמונה לא מקובץ או לא מושלם. לאחר מכן, צור עמודת תזוזה והעתק את הערכים מהעמודה מרחק לעמודה תזוזה.
הקצה באופן ידני את אירועי ההרחבה והנסיגה עבור כל קצה ענף. אם זוהי הרחבה, השאר את ערך ההנעה החיובי ללא שינוי. אם זוהי נסיגה, שנה את ערך ההנעה המתאים לערך שלילי.
לאחר מכן, בעמודת אירוע חדשה, סכם את ערכי ההנעה עבור אירועי הרחבה והתפטרות בודדים. בסרטון זה, ניתן לצפות בסדרת תמונות מוקרנת בעוצמה מרבית שנאספה מנציג המסוקרן בנפרד כנוירון גחוני. תמונות של מסגרת בודדת מאפשרות הערכה של אירועי הנסיגה וההרחבה.
מעקב 4D Semiautomated של מסופי הענף מאפשר ביאור של מסופי הענף הדינמיים של נוירונים גחוניים המסומן בנפרד כמודגמים. חישוב הכיוון והמרחק של תנועות הענף בכל נקודת זמן מאפשר השוואה של דינמיקת הענף הדנדריטי לנוירונים גחונים המסווים בנפרד בשלבים התפתחותיים שונים. הצעד החשוב ביותר הוא שמירה על שלמות רקמת המוח ומורפולוגיה דנדריט במהלך ניתוח הרכבה.
איכות סדרת התמונות הגולמיות היא גם קריטית למעקב וכמות מוצלחים. באמצעות טכניקה זו רכשנו את היכולת לבצע ניתוח כמותי של דנדריט פילופודיה בפיתוח נוירונים מרכזיים drosophila ולחקור את המכונות המולקולריות הקשורות התבגרות דנדריט ו synaptogenesis.
