Этот протокол обеспечивает новый подход к количественной динамике ветви дендритной беседки и разработке нейронов с использованием живой промежуток времени изображения и 3D-изображение аннотации программного обеспечения. Этот метод изображения и отслеживает ветви терминалов, обеспечивая быстрый и эффективный метод для измерения динамического поведения дендритных филоподии. Исследования с использованием этого метода дают представление о том, как развитие и активность регулируют дендритный морфогенез.
Наши методы применимы к редко помеченным нейронам как в пробирке, так и в настройках in vivo. При выполнении этой процедуры помните, что параметры изображения должны быть тщательно скорректированы для достижения достаточного временного и пространственного разрешения. Для сбора мозгов из личинки дрозофилы, под рассечением микроскопа использовать одну пару номер пять стандартных миппов вскрытия кончика провести личинки образца на месте при использовании других тщательно вскрыть мозг, сохраняя глазные диски, мозговые доли, и брюшной нервный шнур.
Затем удалите прикрепленные мышцы, чтобы свести к минимуму любое движение образца во время визуализации. Когда все мозги были собраны, использовать вакуумную смазку, чтобы нарисовать квадратную камеру на стеклянную горку и добавить 20 микролитров внешнего солевого раствора в камеру. Используйте типсы, чтобы перенести мозг в камеру и настроить положение мозга под микроскопом с спинной стороны вверх.
Обложка камеры со стеклянной крышкой скольжения и нажмите осторожно на крышку скольжения, чтобы уменьшить образец дрейфующих во время процедуры визуализации. Для идентификации эксплантов мозга, содержащих индивидуально помеченные нейроны, в течение 30 минут после вскрытия выберите цель погружения в воду 40X и источник света эпифлуоресценции. Выберите два фотона лазера настроены на 920 нанометров и не Dscan детектор и установить параметры изображения для сбора изображений на 512 на 512 пикселей на кадр и одну минуту на стек в течение 10 минут.
Затем отрегулируйте оптический и цифровой зум, чтобы достичь достаточного разрешения X, Y, q, обеспечивая при этом покрытие всей дендритической беседки в течение одной минуты. Настройки будут генерировать изображения с типичным X, Y, разрешением 0,11 на 0,11 на 0,25 микрометра. Для коррекции дрейфа откройте файл, представляющий интерес в подходящей программе коррекции дрейфа, и нажмите Редактировать и редактировать микроскопические параметры.
Установите тип микроскопа на Wide Field для двух фотон-изображений, если есть два фотона вариант и следуйте рабочему процессу, определяемому программным обеспечением. Для деконволюции откройте занос исправленное изображение в программном обеспечении для деконволюции и следуйте рабочему процессу. Затем сохраните деконволюции изображения в типе файла, который поддерживается последующим программным обеспечением аннотации изображения, способным анализировать 4D-данные и сообщать пространственные координаты определенных пятен в изображении.
Для аннотации изображения откройте deconvolved изображение в программном обеспечении аннотации изображения и изучить и отметить советы ветви в любое время точек в 3D. Программное обеспечение аннотации изображения будет сообщать и хранить пространственные и временные координаты отмеченных кончиков веток. Экспорт координатной информации в качестве файла CSV для последующих расчетов.
В модуле «Пятна» щелкните «Пропустить автоматическое творение», «Изменить вручную» и проверьте автоматическое подключение к выбранному кассу Spot. Просмотрите кадры в временных рядах и выберите ветку для аннотации. Удерживая клавишу Shift, нажмите на кончик терминала филиала, чтобы добавить пятно.
Затем нажмите на вкладку Статистика, выберите подробные, конкретные значения и позиции. Будет отображаться записанная информация о пространственных и временных координат. Нажмите Сохранить для экспорта данных в качестве файла CSV.
Чтобы вычислить размещение наконечника ветви в 3D, откройте файл CSV в качестве электронной таблицы и выберите столбец Track ID. Нажмите Сортировать Малейший к крупнейшему и принять Расширить выбор. После сортировки Track ID определит каждую уникальную дендритную ветвь, а пятна из одной и той же ветви имеют один и тот же track ID.The Time столбец будет хранить информацию из разных временных рамок.
В электронной таблице добавьте столбец Расстояния и используйте координаты для расчета расстояния каждых двух временно смежных пятен. Для измерения незначительных движений на одном уровне вокселя сбросьте все значения расстояния меньше 0,3 микрометра для фильтрации любой неисправленной дрейфующей или несовершенной аннотации изображения. Затем создайте столбец перемещения и скопируйте значения из столбца Расстояние в столбец перемещения.
Вручную назначьте события расширения и опровержения для каждого наконечника ветви. Если это расширение, оставьте положительное значение перемещения неизменным. Если это опровержение, измените соответствующее значение перемещения на отрицательное значение.
Затем в новой колонке Event суммировать значения перемещения для отдельных событий расширения и опровержения. В этом видео, максимальная интенсивность прогнозируемых изображений серии собраны из представителя индивидуально помечены брюшной боковой нейрон можно наблюдать. Изображения одного кадра позволяют дать оценку событиям опровержения и расширения.
Полуавтомированное 4D слежение за терминалами ветви позволяет аннотировать динамические ветви терминалов индивидуально помеченных вентраловых боковой нейронов, как попродемонстрировано. Расчет направления и расстояния движений ветви в каждой точке времени позволяет сравнить дендритную динамику ветви для индивидуально обозначенных вентраловых боковой нейронов на разных стадиях развития. Наиболее важным шагом является сохранение целостности ткани мозга и дендрита морфолоя во время вскрытия и монтажа.
Качество необработанных изображений также имеет решающее значение для успешного отслеживания и количественной оценки. Используя этот метод, мы получили возможность выполнять количественный анализ дендрита филоподии при разработке центральных нейронов дрозофилы и исследовать молекулярный механизм, связанный с созреванием дендрита и синаптогенезом.
