פרוטוקול זה הוא משמעותי כי זה מאפשר למדענים לבצע ניתוח גנטי פשוט של מחלת נבול חיידקי בעגבניות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי המניפולציה של ביטוי גנים ובדיקות הבאות ניתן לבצע בזמן קצר עם הדרישות הקטנות של ציוד ומרחב גידול הצמח. זוהי שיטה היא מאוד תכליתי, וזה עשוי להיות מיושם על צמחי יבול אחרים לבצע הן חיסון פתוגן ומיסיונים פיזיולוגיים אחרים.
כדי לשמור על סטריליות במהלך מניפולציה של שתילים במבחנה, חשוב לשמור על הצלחות סגורות כאשר הם מחוץ למכסה המנוע זרימה. זוהי טכניקה קלה, אבל זה דורש צעדים מרובים למניפולציה. הדמיה של שיטה זו תסייע לראות טריקים קטנים שקשה להסביר בכתב היד, ותסייע לחוקרים אחרים ליישם את השיטה במעבדות שלהם.
עוזר להדגים את ההליך הזה יהיה Achen זאו, סטודנט לתואר שני. לאחר עיקור ושטיפת זרעי העגבניות, מעבירים אותם למדיום מוראשיג' וסקוב חצי כוח ללא סוכרוז. שמור את הזרעים בחושך בטמפרטורה בין 25 ל 28 מעלות צלזיוס במשך שלושה ימים.
מניחים מסנני פטרי בגודל 8.5 ס"מ רבועים בתוך מנות פטרי בגודל 9 ס"מ מרובע המכילות מדיום מוראשיג' וסקוק בחצי חוזק, וממקמים שישה זרעי עגבניות נובטים על כל צלחת. לאטום את הצלחת עם סרט Micropore, ו דגירה הזרעים נבט ב 25 עד 28 מעלות צלזיוס במשך שלושה עד ארבעה ימים. לגדל את קנה שורש Agrobacterium MSU440 במדיום מוצק LB עם אנטיביוטיקה מתאימה במשך יומיים ב 28 מעלות צלזיוס לפני טרנספורמציה צמחית.
באמצעות אזמל סטרילי, לחתוך את הרדן ואת החלק התחתון של hypocotyl של שתילי עגבניות. השתמש טיפים מפלסטיק או להב אזמל כדי לקצור ביומסה A.rhizogenes מפני השטח של מדיום LB, בזהירות לטבול את שתילי עגבניות לחתוך ביומסה חיידקית. לאחר מכן, מכסים את שתילי העגבניות בנייר מסנן חצי מעגלי באורך שני ס"מ על-ידי ארבעה ס"מ על מנת לשמור על לחות גבוהה ולאפשר הישרדות ופיתוח שורשים חדשים.
חשוב לשמור על השתילים בלחות גבוהה בסביבה המאפשרת התרחשות. כדי לעשות זאת, לכסות את השתילים עם נייר מסנן, ולסגור את הצלחת עם סרט Micropore. אחסן את שתילי העגבניות שהשתנו במשך שישה עד שבעה ימים בתא צמיחה בטמפרטורה שבין 25 ל -28 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן השתמש אזמל סטרילי לחתוך את השורשים השעיר המתעוררים החדשים, ולאפשר שתילים לייצר שורשים שערים חדשים. לאחר הדור השני של שורשים שעירים חדשים מופיע, להסיר את נייר המסנן על גבי השתילים, ולאטום את הצלחת עם סרט Micropore שוב. כדי לדמיין פלואורסצנטיות DsRed או כל ציוד אחר עבור הצמח בהדמיה vivo, לסמן את השורשים השתנו חיובי, אשר ניתן לזהות על ידי פלואורסצנטיות אדומה.
השתמש אזמל כדי להסיר את השורשים השליליים שאינם השתנו, אשר ניתן לזהות על ידי חוסר פלואורסצנטיות אדומה שלהם. מעבירים את השתילים ה מראים פלואורסצנטיות אדומה לצלחת חדשה המכילה חצי כוח Murashige ו סקוג בינוני על מנת להקל על הפיתוח של השורש השתנה כמו השורש העיקרי. שמור את השתילים שלא מראים פלואורסצנטיות אדומה באותה צלחת כדי לבדוק את הופעתם של שורשים פלואורסצנטיים בנקודות זמן מאוחרות יותר.
מכסים את השתילים בנייר מסנן חצי-עיגול באורך שני ס"מ על ארבעה ס"מ, אוטמים את הצלחת ודקרים את השתילים כדי לאפשר להם לפתח שורשים שערים חדשים. מכינים את סירי החיסון שבהם פני השטח של השורשים ייחשפו לאנוקולום החיידקי על ידי השריית סירי החיסון במים, שפיכת מים עודפים, ולאחר מכן הנחתם במגש נטיעת פלסטיק. באמצעות פינצטה, להעביר את השתילים שנבחרו עם שורשים טרנספורמציה סירי חיסון.
מכסים את המגש בניילון נצמד או במכסה שקוף, ולשמור אותם בטמפרטורה של 25 עד 28 מעלות צלזיוס עם 65% לחות. הסר את הכיסוי לאחר חמישה או שישה ימים. לגדל רלסטוניה בחמישה LB נוזלי בינוני בשייקר מסלולית ב 28 מעלות צלזיוס, עם רעידות ב 200 סל"ד, עד השלב נייח.
למדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר כדי לקבוע את מספרי החיידקים. לדלל את התרבות החיידקית עם מים כדי OD600 של 1. מניחים 16 עד 20 סירי חיסון המכילים צמחי עגבניות שהפכו למגש חיסון.
לאחר מכן יוצקים 300 מיליליטר של אינוקולום חיידקי מדולל לתוך המגש, ומאפשרים לצמחים להשרות את inoculum במשך 20 דקות. לאחר מכן, להכין מגש חדש עם שכבה של אדמה שתיל. מעבירים את הסירים החוסנים למגש החדש, וממקמים את המגשים בתא צמיחה עם 75% לחות, טמפרטורה בין 26 ל -28 מעלות צלזיוס, ו photoperiod של 12 שעות של אור ו 12 שעות של חושך.
כאן, שורשי עגבניות משתנים מחוסנים עם רלסטוניה לבצע ניתוח גנטי פשוט לחקר מחלת נבול חיידקי. התפתחות תסמיני המחלה נמצאת במעקב בצמחי עגבניות עם שורשים שעברו טרנספורמציה עם וקטור ריק ואלה שעברו טרנספורמציה עם מבנה RAI מיקוד עגבניות CESA6. נתוני מדד המחלה נאספים מאותה יחידה ניסיונית לאורך זמן על פי סולם שרירותי מאפס לארבעה ולא עוקבים אחר התפלגות גאוסיאנית, שוללים את השימוש בבדיקות סטנדרטיות לנתונים פרמטריים.
כגישה סטנדרטית, נעשה שימוש בעקומות U Mann-Whitney, דו-זנביות ולא פרמטריות להשוואת עקומות הבקרה והזיהום. על פי ניתוח זה, ההבדל בין החציונים של שתי העקומות נראה לא משמעותי. ניתן גם לכמת את האזור תחת עקומת התקדמות המחלה, המאפשרת שילוב תצפיות מרובות של התקדמות המחלה לערך אחד.
האזור תחת עקומת התקדמות המחלה מראה ערך גבוה יותר עבור צמחי בקרה לעומת צמחי עגבניות CESA6 RNAi בסוף תהליך ההדבקה, המציין כי צמחים מושתקים CESA6 עגבניות עמידים יותר לזיהום רלסטוניה מאשר צמחים בקרה. מרווחי בר-סמך מציעים דרך להעריך, בהסתברות גבוהה, טווח ערכים שבו נמצא ערך האוכלוסיה של משתנה נתון. כפי שניתן לראות כאן, האזור של מרווח הביטחון של 95% עבור עקומות הבקרה והזיהום מעריך סיכוי גבוה יותר להתנגדות כאשר CESA6 מושתק.
ערכי מדד המחלה יכולים להפוך לנתונים בינאריים, בהתחשב במדד מחלה נמוך משניים המתאימים לאפס ואינדקס מחלות שווה או גבוה משניים המתאימים לאחד. זה מאפשר ייצוג של עקומת הישרדות לאחר חיסון רלסטוניה. ההבדלים בשיעור ההישרדות בין השליטה לצמחים הנגועים אינם מובהקים סטטיסטית על פי המבחן הסטטיסטי של גהאן-ברסלו-וילקוקסון.
הביטוי של CESA6 מנותח לאחר מכן בשני שורשים שנבחרו באקראי שהשתנו לפני שלב החיסון, מה שמראה שההתנגדות המשופרת לרלסטוניה תואמת את הביטוי המופחת של CESA6. לאחר שני סבבי בחירה, ניתן להשיג שיעור המרה של 35 עד 40% וערך זה ניתן להגדיל על-ידי ביצוע סיבובי בחירה נוספים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לשמור על השתילים מכוסים בפיסת נייר סינון כדי לשמור על לחות גבוהה ולאטום את הצלחות עם Micropore כדי להבטיח החלפת גז.
לאחר טרנספורמציית השורש, ניתן ליישם רבים מהטיפולים כדי לחקור את תגובת הצמח על ידי התבוננות בפיזיולוגיה של השורש או באמצעות ביולוגיה מולקולרית, ביולוגיה של התא או ביוכימיה. בעיקר, טכניקה זו תאפשר לחוקרים עם משאבים מוגבלים לבצע ניתוח גנטי של זיהום חיידקי בשורשי עגבניות.
