이 프로토콜은 과학자들이 토마토에서 세균성 wilt 질병의 간단한 유전 분석을 수행 할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 유전자 발현 및 후속 검사의 조작이 단기간에 장비 및 식물 성장 공간의 작은 요구 사항으로 수행 될 수 있다는 것입니다. 이것은 방법이 매우 다재다능하며 병원체 접종 및 기타 생리적 검사를 수행하기 위해 다른 작물 식물에 적용 될 수 있습니다.
체외에서 모종을 조작하는 동안 멸균을 유지하기 위해, 그들은 흐름 후드 의 외부에있을 때 플레이트를 닫아 유지하는 것이 중요하다. 이것은 쉬운 기술이지만 조작을 위해 여러 단계가 필요합니다. 이 방법의 시각화는 원고에서 설명하기 어려운 작은 트릭을 보는 데 도움이 될 것입니다, 자신의 실험실에서 방법을 구현하는 다른 연구자 도움.
이 절차를 입증하는 데 도움이 아헨 자오, 대학원생이 될 것입니다. 토마토 씨를 살균하고 세척한 후, 자당없이 반강도 무라시게와 스쿠그 배지로 옮긴다. 3 일 동안 25 ~28도 사이의 온도에서 어둠 속에서 씨앗을 유지합니다.
반강도 무라시게와 스쿠그 매체가 포함된 9평방센티미터 페트리 접시 안에 오토클레이브 8.5평방센티미터 의 필터를 놓고 각 접시에 발아 토마토 씨앗 6개를 놓습니다. 마이크로포어 테이프로 접시를 밀봉하고 발아 씨앗을 3~4일 동안 섭씨 25~28도에서 배양합니다. 식물 변환 전에 섭씨 28도에서 2 일 동안 적절한 항생제로 고체 LB 배지에서 Agrobacterium rhizogenes MSU440을 성장하십시오.
멸균 메스를 사용하여 토마토 모종의 고체 코틸의 방광과 바닥을 자른다. 플라스틱 팁이나 메스 블레이드를 사용하여 LB 배지 표면에서 A.rhizogenes 바이오매스를 수확하고 박테리아 바이오 매스에서 잘라낸 토마토 묘목을 조심스럽게 담급하십시오. 그 후, 높은 습도를 유지하고 생존과 새로운 뿌리 개발을 용이하게하기 위해 2 센티미터 4 센티미터 반원형 필터 용지와 토마토 묘목을 커버.
모종을 고습도 유지하게 하는 환경의 경우 발생이 가능합니다. 이렇게 하려면 모종을 필터 용지로 덮고 마이크로포어 테이프로 플레이트를 닫습니다. 변형된 토마토 묘목을 섭씨 25~28도의 온도로 성장 챔버에 6~7일 동안 보관하십시오.
그런 다음 멸균 메스를 사용하여 새로운 털이 많은 뿌리를 자르고 모종이 새로운 털이 많은 뿌리를 생성 할 수 있게합니다. 새로운 털이 뿌리의 2 세대가 나타나면, 묘목 위에 필터 종이를 제거하고 다시 마이크로 포어 테이프로 접시를 밀봉. DsRed 형광 또는 생체 내 이미징 내 식물을 위한 다른 장비를 시각화하려면 적색 형광으로 식별 될 수있는 긍정적 인 변형 뿌리를 표시하십시오.
메스를 사용하여 적색 형광의 부족으로 식별 될 수있는 부정적인 비 변형 뿌리를 제거하십시오. 변형된 뿌리의 개발을 용이하게 하기 위해 반강도 무라시게및 스쿠그 배지를 포함하는 새로운 플레이트에 적색 형광을 보이는 묘목을 전달한다. 같은 접시에 적색 형광이 나타나지 않는 묘목을 유지하여 나중에 형광 뿌리의 출현을 확인하십시오.
모종을 2센티미터/4센티미터 반원 필터 용지로 덮고, 접시를 밀봉하고, 모종을 배양하여 새로운 털이 많은 뿌리를 개발합니다. 뿌리의 표면이 먼저 물로 접종 냄비를 담그고, 여분의 물을 부어 플라스틱 심기 트레이에 놓음으로써 뿌리의 표면이 세균 접종에 노출될 예방 접종 냄비를 준비하십시오. 핀셋을 사용하여 선택한 묘목을 변형된 뿌리로 접종 냄비로 옮킵니다.
트레이를 플라스틱 랩이나 투명 뚜껑으로 덮고 습도가 65%인 섭씨 25~28도까지 유지하십시오. 5~6일 후에 덮개를 제거합니다. 궤도 셰이커에서 5LB 액체 배지에서 랄스토니아를 성장, 200 rpm에서 흔들어, 고정 된 단계까지.
600 나노미터에서 광학 밀도를 측정하여 세균 수를 결정합니다. 1의 OD600에 물로 세균 배양을 희석. 변형된 토마토 식물을 포함하는 16-20개의 접종 냄비를 접종 트레이에 넣습니다.
그런 다음 300 밀리리터의 희석된 세균 접종을 트레이에 붓고 식물이 20 분 동안 접종에 담글 수 있게합니다. 그 후, 포팅 토양의 층으로 새로운 트레이를 준비합니다. 접종된 냄비를 새 트레이에 넣고 75%의 습도, 섭씨 26~28도 사이의 온도, 12시간의 빛과 12시간의 어둠의 광기간을 가진 성장 챔버에 트레이를 놓습니다.
여기서 토마토 뿌리는 성모세포와 함께 변형되고 접종되어 세균성 위트 질환 연구를 위한 간단한 유전자 분석을 수행합니다. 질병 현상의 발달은 빈 벡터로 변형된 뿌리와 토마토 CESA6를 표적으로 하는 RAI 구조로 변형된 그 와 토마토 식물에서 추적됩니다. 질병 지수 데이터는 0에서 4까지 임의의 척도에 따라 시간이 지남에 따라 동일한 실험 단위에서 수집되며 가우시안 분포를 따르지 않으며 파라메트릭 데이터에 대한 표준 테스트의 사용을 배제합니다.
표준 접근법으로, U Mann-Whitney, 두 꼬리, 비 파라메트릭 테스트가 사용되어 제어 및 감염 곡선을 모두 비교합니다. 이 분석에 따르면 두 곡선의 중앙값 간의 차이는 중요하지 않은 것으로 보입니다. 또한 질병 진행 곡선 하에서 영역을 정량화할 수 있으며, 이는 질병의 여러 관측을 단일 값으로 결합할 수 있다.
질병 진행 곡선 아래 영역은 감염 과정의 끝에 토마토 CESA6 RNAi 식물에 비해 제어 식물에 대한 높은 가치를 보여줍니다, 토마토 CESA6 침묵 식물은 제어 식물보다 랄스토니아 감염에 더 저항한다는 것을 나타내는. 신뢰 도면은 지정된 변수의 모집단 값이 발견되는 값의 범위가 높을 확률이 높은 예측 방법을 제공합니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 제어 및 감염 곡선에 대한 95% 신뢰 구간의 영역은 CESA6이 침묵할 때 저항의 더 높은 확률을 추정합니다.
질병 지수 값은 0에 해당하는 2개 미만의 질병 지수와 질병에 해당하는 2개 이상의 질병 지수를 고려하여 이진 데이터로 변환될 수 있으며, 질병 지수가 하나에 해당하는 2개 이상입니다. 이를 통해 랄스토니아 접종 후 생존 곡선을 나타낼 수 있습니다. 게한 브레슬로-윌콕슨 통계 시험에 따르면 대조군과 감염된 식물 간의 생존율 차이는 통계적으로 유의하지 않다.
CESA6의 발현은 접종 단계 전에 무작위로 선택된 두 개의 변형된 뿌리로 분석되어 Ralstonia에 대한 강화된 저항이 CESA6의 감소된 발현과 상관관계가 있음을 보여준다. 두 번의 선택 후에는 35~40%의 변환 율을 얻을 수 있으며, 추가 선택 라운드를 수행하여 이 값을 높일 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안, 높은 습도를 유지하고 가스 교환을 보장하기 위해 마이크로 포어로 플레이트를 밀봉하기 위해 필터 종이 조각으로 덮여 묘목을 유지하는 것이 중요합니다.
루트 변환 후, 많은 치료법이 뿌리 생리학의 관찰 또는 분자 생물학, 세포 생물학 또는 생화학을 사용하여 식물 반응을 연구하기 위해 적용될 수 있다. 주로,이 기술은 제한된 자원을 가진 연구원이 토마토 뿌리에 있는 세균성 감염의 유전 분석을 능력을 발휘할 수 있게 합니다.
