Questo protocollo è significativo perché consente agli scienziati di eseguire semplici analisi genetiche della malattia da appassimento batterico nel pomodoro. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la manipolazione dell'espressione genica e dei test successivi può essere eseguita in breve tempo e con i piccoli requisiti delle attrezzature e dello spazio di crescita delle piante. Questo metodo è molto versatile e può essere applicato ad altre piante coltivate per eseguire sia l'inoculazione patogena che altri saggi fisiologici.
Per mantenere la sterilità durante la manipolazione delle piantine in vitro, è importante tenere le piastre chiuse quando sono al di fuori della cappa di flusso. Questa è una tecnica semplice, ma richiede più passaggio per la manipolazione. La visualizzazione di questo metodo aiuterà a vedere piccoli trucchi che sono difficili da spiegare nel manoscritto, aiutando altri ricercatori a implementare il metodo nei loro laboratori.
A dimostrare questa procedura sarà Achen Zhao, uno studente laureato. Dopo aver sterilizzato e lavato i semi di pomodoro, trasferirli a semi-forza Murashige e mezzo Skoog senza saccarosio. Tenere i semi al buio a una temperatura compresa tra 25 e 28 gradi Celsius per tre giorni.
Posizionare filtri autoclavati di 8,5 centimetri quadrati all'interno di piastre di Petri di nove centimetri quadrati contenenti semi-forza Murashige e Skoog medium, e posizionare sei semi di pomodoro germinati su ogni piatto. Sigillare il piatto con nastro micropore e incubare i semi germinati a 25-28 gradi Celsius per tre o quattro giorni. Far crescere l'Agrobacterium rhizogenes MSU440 in mezzo LB solido con antibiotici appropriati per due giorni a 28 gradi Celsius prima della trasformazione delle piante.
Usando un bisturi sterile, tagliare il radio e il fondo dell'ipocotile delle piantine di pomodoro. Utilizzare punte di plastica o una lama bisturi per raccogliere biomassa A.rhizogenes dalla superficie del mezzo LB e immergere con cura le piantine di pomodoro tagliate nella biomassa batterica. Successivamente, coprire le piantine di pomodoro con una carta filtrante semicircolare di due centimetri per quattro centimetri al fine di mantenere un'elevata umidità e facilitare la sopravvivenza e il nuovo sviluppo delle radici.
È importante mantenere le piantine in alta umidità in un ambiente che consenta la traspirazione. Per fare ciò, coprire le piantine con carta da filtro e chiudere la piastra con nastro Micropore. Conservare le piantine di pomodoro trasformate per sei-sette giorni in una camera di crescita a una temperatura compresa tra 25 e 28 gradi Celsius.
Quindi utilizzare un bisturi sterile per tagliare le nuove radici pelose emergenti e consentire alle piantine di produrre nuove radici pelose. Una volta che appare la seconda generazione di nuove radici pelose, rimuovere la carta filtrante sopra le piantine e sigillare nuovamente la piastra con nastro Micropore. Per visualizzare la fluorescenza DsRed o qualsiasi altra apparecchiatura per l'imaging in vivo vegetale, contrassegnare le radici trasformate positive, che possono essere identificate dalla fluorescenza rossa.
Usa un bisturi per rimuovere le radici negative non trasformate, che possono essere identificate dalla loro mancanza di fluorescenza rossa. Trasferire le piantine che mostrano fluorescenza rossa su una nuova piastra contenente mezzo mezzo di resistenza Murashige e Skoog al fine di facilitare lo sviluppo della radice trasformata come radice principale. Mantenere le piantine che non mostrano fluorescenza rossa nella stessa piastra per controllare l'emergere di radici fluorescenti nei punti di tempo successivi.
Coprire le piantine con una carta filtrante semicerchiata di due centimetri per quattro centimetri, sigillare la piastra e incubare le piantine per farle sviluppare nuove radici pelose. Preparare i vasi di inoculazione in cui la superficie delle radici sarà esposta all'inoculo batterico immergendo prima i vasi di inoculazione con acqua, versando l'acqua in eccesso e quindi mettendoli in un vassoio di piantagione di plastica. Utilizzando le pinzette, trasferire le piantine selezionate con radici trasformate nei vasi di inoculazione.
Coprire il vassoio con un involucro di plastica o un coperchio trasparente e mantenerli a 25-28 gradi Celsius con umidità del 65%. Rimuovere il coperchio dopo cinque o sei giorni. Far crescere Ralstonia in cinque mezzi liquidi LB in uno shaker orbitale a 28 gradi Celsius, con scuotimento a 200 giri/min, fino alla fase stazionaria.
Misurare la densità ottica a 600 nanometri per determinare i numeri batterici. Diluire la coltura batterica con acqua a un OD600 di 1. Posizionare da 16 a 20 vasi di inoculazione che contengono piante di pomodoro trasformate in un vassoio di inoculazione.
Quindi versare 300 millilitri di inoculo batterico diluito nel vassoio e lasciare che le piante ammollo nell'inoculo per 20 minuti. Dopo questo, preparare un nuovo vassoio con uno strato di terreno invaso. Spostare i vasi inoculati nel nuovo vassoio e posizionare i vassoi in una camera di crescita con il 75% di umidità, una temperatura compresa tra 26 e 28 gradi Celsius e un fotoperiodo di 12 ore di luce e 12 ore di oscurità.
Qui, le radici di pomodoro vengono trasformate e inoculate con Ralstonia per eseguire semplici analisi genetiche per lo studio della malattia da wilt batterica. Lo sviluppo dei sintomi della malattia è monitorato in piante di pomodoro con radici trasformate con un vettore vuoto e quelle trasformate con un costrutto RAI mirato al pomodoro CESA6. I dati dell'indice di malattia vengono raccolti dalla stessa unità sperimentale nel tempo secondo una scala arbitraria da zero a quattro e non seguono una distribuzione gaussiana, escludendo l'uso di test standard per i dati parametrici.
Come approccio standard, viene utilizzato un test U Mann-Whitney, a due code, non parametrico per confrontare sia le curve di controllo che le curve di infezione. Secondo questa analisi, la differenza tra le mediane di entrambe le curve sembra non essere significativa. È anche possibile quantificare l'area sotto la curva di avanzamento della malattia, che consente di combinare più osservazioni del progresso della malattia in un unico valore.
L'area sotto la curva di avanzamento della malattia mostra un valore più elevato per le piante di controllo rispetto alle piante di pomodoro CESA6 RNAi alla fine del processo di infezione, indicando che le piante silenziate dal pomodoro CESA6 sono più resistenti all'infezione da Ralstonia rispetto alle piante di controllo. Gli intervalli di confidenza offrono un modo per stimare, con alta probabilità, un intervallo di valori in cui si trova il valore della popolazione di una data variabile. Come si vede qui, l'area dell'intervallo di confidenza del 95% per le curve di controllo e infezione stima una maggiore probabilità di resistenza quando cesa6 viene silenziato.
I valori dell'indice di malattia possono essere trasformati in dati binari, considerando un indice di malattia inferiore a due corrispondente a zero e un indice di malattia uguale o superiore a due corrispondente a uno. Ciò consente la rappresentazione di una curva di sopravvivenza dopo l'inoculazione di Ralstonia. Le differenze nel tasso di sopravvivenza tra il controllo e le piante infette non sono statisticamente significative secondo il test statistico di Gehan-Breslow-Wilcoxon.
L'espressione del CESA6 viene quindi analizzata in due radici trasformate selezionate casualmente prima della fase di inoculazione, dimostrando che la maggiore resistenza alla Ralstonia è correlata alla ridotta espressione del CESA6. Dopo due turni di selezione, è possibile ottenere un tasso di trasformazione dal 35 al 40% e questo valore può essere aumentato eseguendo turni di selezione aggiuntivi. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante mantenere le piantine coperte da un pezzo di carta da filtro per mantenere alta l'umidità e sigillare le piastre con Micropore per garantire lo scambio di gas.
Dopo la trasformazione delle radici, molti dei trattamenti possono essere applicati per studiare la risposta delle piante mediante osservazione della fisiologia delle radici o usando biologia molecolare, biologia cellulare o biochimica. Principalmente, questa tecnica consentirà ai ricercatori con risorse limitate di eseguire analisi genetiche dell'infezione batterica nelle radici di pomodoro.
