Ce protocole est significatif parce qu’il permet aux scientifiques d’effectuer une analyse génétique simple de la maladie bactérienne du flétrissement dans la tomate. Le principal avantage de cette technique est que la manipulation de l’expression des gènes et des analyses subséquentes peut être effectuée en peu de temps et avec les petites exigences de l’équipement et de l’espace de croissance des plantes. Il s’agit d’une méthode très polyvalente, et elle peut être appliquée à d’autres plantes cultivées pour effectuer à la fois l’inoculation des pathogènes et d’autres analyses physiologiques.
Pour maintenir la stérilité lors de la manipulation des semis in vitro, il est important de garder les plaques fermées lorsqu’elles sont à l’extérieur du capot d’écoulement. Il s’agit d’une technique facile, mais il nécessite plusieurs étapes pour la manipulation. La visualisation de cette méthode aidera à voir de petits trucs qui sont difficiles à expliquer dans le manuscrit, aidant d’autres chercheurs à mettre en œuvre la méthode dans leurs laboratoires.
Achen Zhao, étudiante diplômée, aidera à démontrer cette procédure. Après stérilisation et lavage des graines de tomate, les transférer à mi-force Murashige et Skoog moyen sans saccharose. Gardez les graines dans l’obscurité à une température comprise entre 25 et 28 degrés Celsius pendant trois jours.
Placez des filtres autoclavés de 8,5 centimètres carrés à l’intérieur de boîtes Petri de neuf centimètres carrés contenant du murashige mi-résistance et du milieu Skoog, et placez six graines de tomates germées dans chaque assiette. Sceller l’assiette avec du ruban micropore et incuber les graines germées à 25 à 28 degrés Celsius pendant trois à quatre jours. Cultivez l’Agrobacterium rhizogenes MSU440 dans un milieu LB solide avec des antibiotiques appropriés pendant deux jours à 28 degrés Celsius avant la transformation des plantes.
À l’aide d’un scalpel stérile, couper le radicle et le fond de l’hypocotyle des semis de tomates. Utilisez des pointes en plastique ou une lame de scalpel pour récolter la biomasse A.rhizogenes à la surface du milieu LB, et trempez soigneusement les semis de tomates coupées dans la biomasse bactérienne. Après cela, couvrir les semis de tomates avec un papier filtre semi-circulaire de deux centimètres par quatre centimètres afin de maintenir une humidité élevée et de faciliter la survie et le développement de nouvelles racines.
Il est important de maintenir les semis dans une humidité élevée dans un environnement qui permet la transpiration. Pour ce faire, couvrir les semis de papier filtre et fermer la plaque avec du ruban Micropore. Conserver les semis de tomates transformés de six à sept jours dans une chambre de croissance à une température comprise entre 25 et 28 degrés Celsius.
Ensuite, utilisez un scalpel stérile pour couper les nouvelles racines poilues émergentes, et permettre aux semis de produire de nouvelles racines poilues. Une fois que la deuxième génération de nouvelles racines poilues apparaît, retirez le papier filtre sur les semis et scellez à nouveau la plaque avec du ruban Micropore. Pour visualiser la fluorescence DsRed ou tout autre équipement pour l’imagerie in vivo végétale, marquez les racines transformées positives, qui peuvent être identifiées par la fluorescence rouge.
Utilisez un scalpel pour éliminer les racines négatives non transformées, qui peuvent être identifiées par leur manque de fluorescence rouge. Transférer les semis qui présentent la fluorescence rouge dans une nouvelle plaque contenant des mi-résistances murashige et skoog moyen afin de faciliter le développement de la racine transformée comme racine principale. Gardez les semis qui ne montrent pas la fluorescence rouge dans la même plaque pour vérifier l’émergence des racines fluorescentes dans les points de temps ultérieurs.
Couvrir les semis d’un papier filtre semi-cercle de deux centimètres par quatre centimètres, sceller l’assiette et incuber les semis pour les laisser développer de nouvelles racines poilues. Préparer les pots d’inoculation où la surface des racines sera exposée à l’inoculum bactérien en trempant d’abord les pots d’inoculation avec de l’eau, en versant tout excès d’eau, puis en les plaçant dans un bac de plantation en plastique. À l’aide d’une pince à épiler, transférer les semis sélectionnés avec des racines transformées dans les pots d’inoculation.
Couvrez le plateau d’une pellicule plastique ou d’un couvercle transparent, et gardez-les à 25 à 28 degrés Celsius avec 65% d’humidité. Retirer le couvercle après cinq ou six jours. Cultivez Ralstonia en cinq LB liquide moyen dans un shaker orbital à 28 degrés Celsius, avec secousses à 200 rpm, jusqu’à la phase stationnaire.
Mesurez la densité optique à 600 nanomètres pour déterminer les nombres bactériens. Diluer la culture bactérienne avec de l’eau à un OD600 de 1. Placer 16 à 20 pots d’inoculation contenant des plants de tomates transformés en plateau d’inoculation.
Verser ensuite 300 millilitres d’inoculum bactérien dilué dans le plateau et laisser tremper les plantes dans l’inoculum pendant 20 minutes. Après cela, préparer un nouveau plateau avec une couche de terre mise en pot. Déplacez les pots inoculés dans le nouveau plateau, et placez les plateaux dans une chambre de croissance avec 75% d’humidité, une température comprise entre 26 et 28 degrés Celsius, et une photopériod de 12 heures de lumière et 12 heures d’obscurité.
Ici, les racines de tomates sont transformées et inoculées avec Ralstonia pour effectuer une analyse génétique simple pour l’étude de la maladie bactérienne du flétrissement. Le développement des symptômes de la maladie est suivi dans les plants de tomates dont les racines sont transformées avec un vecteur vide et ceux transformés avec une construction rai ciblant la tomate CESA6. Les données de l’indice de la maladie sont recueillies à partir de la même unité expérimentale au fil du temps selon une échelle arbitraire de zéro à quatre et ne suivent pas une distribution gaussienne, excluant l’utilisation de tests standard pour les données paramétriques.
Comme approche standard, un test non paramétrique à deux queues U Mann-Whitney pour comparer les courbes de contrôle et d’infection est utilisé. Selon cette analyse, la différence entre les médianes des deux courbes semble non significative. Il est également possible de quantifier la zone sous la courbe de progression de la maladie, ce qui permet de combiner de multiples observations du progrès de la maladie en une seule valeur.
La zone sous la courbe de progression de la maladie montre une valeur plus élevée pour les plantes de contrôle par rapport aux plants de tomates CESA6 RNAi à la fin du processus d’infection, ce qui indique que les plantes tomate cesa6-réduits au silence sont plus résistants à l’infection ralstonia que les plantes de contrôle. Les intervalles de confiance offrent un moyen d’estimer, avec une forte probabilité, une gamme de valeurs dans lesquelles la valeur de la population d’une variable donnée se trouve. Comme on le voit ici, la zone de l’intervalle de confiance de 95 % pour les courbes de contrôle et d’infection estime un risque plus élevé de résistance lorsque le CESA6 est réduit au silence.
Les valeurs de l’indice de la maladie peuvent être transformées en données binaires, compte tenu d’un indice de la maladie inférieur à deux correspondant à zéro et d’un indice de maladie égal ou supérieur à deux correspondant à un. Cela permet la représentation d’une courbe de survie après l’inoculation de Ralstonia. Les différences dans le taux de survie entre le contrôle et les plantes infectées ne sont pas statistiquement significatives selon le test statistique de Gehan-Breslow-Wilcoxon.
L’expression de CESA6 est ensuite analysée dans deux racines transformées choisies au hasard avant l’étape d’inoculation, montrant que la résistance accrue à Ralstonia est corrélée avec l’expression réduite de CESA6. Après deux tours de sélection, un taux de transformation de 35 à 40% peut être obtenu, et cette valeur peut être augmentée en effectuant des tours de sélection supplémentaires. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de garder les semis couverts d’un morceau de papier filtre pour maintenir une humidité élevée et sceller les plaques avec Micropore pour assurer l’échange de gaz.
Après la transformation des racines, de nombreux traitements peuvent être appliqués pour étudier la réponse des plantes en observation de la physiologie des racines ou en utilisant la biologie moléculaire, la biologie cellulaire ou la biochimie. Principalement, cette technique permettra aux chercheurs aux ressources limitées d’effectuer une analyse génétique de l’infection bactérienne dans les racines des tomates.
