Bilim adamları domates bakteriyel solgunluk hastalığının basit genetik analizi ni yapmak için izin verir, çünkü bu protokol önemlidir. Bu tekniğin en büyük avantajı, gen ekspresyonu ve sonraki tahlillerin manipülasyonunun kısa sürede ve ekipman ve bitki büyüme alanının küçük gereksinimleriyle yapAbildiğidir. Bu yöntem çok yönlüdür ve hem patojen aşılama ve diğer fizyolojik tahlilleri gerçekleştirmek için diğer bitki bitkilere uygulanabilir.
Fidelerin in vitro manipülasyonu sırasında kısırlığı korumak için, akış kaputunun dışında yken plakaları kapalı tutmak önemlidir. Bu kolay bir tekniktir, ancak manipülasyon için birden çok adım gerektirir. Bu yöntemin görselleştirilmesi, el yazmasında açıklanması zor olan küçük hilelerin görülmesine yardımcı olacak ve diğer araştırmacıların bu yöntemi laboratuvarlarında uygulamalarına yardımcı olacaktır.
Bu prosedürü göstermek için yardımcı Achen Zhao, bir lisansüstü öğrenci olacaktır. Domates tohumlarını sterilize edip yıkadıktan sonra, onları sakarozsuz yarım güçlü Murashige ve Skoog ortamına aktarın. Tohumları 25 ile 28 derece arasında bir sıcaklıkta karanlıkta üç gün bekletin.
Yarım mukavemetli Murashige ve Skoog ortamı içeren dokuz santimetre karelik Petri yemeklerinin içine otoklavlı 8,5 santimetre karelik filtreler yerleştirin ve her tabağa altı tane çimlenmiş domates tohumu yerleştirin. Mikropore bant ile plaka mühür ve 3-4 gün boyunca 25-28 santigrat derece çimlenmiş tohumları kuluçka. Bitki dönüşümünden önce 28 santigrat derecede iki gün boyunca uygun antibiyotikler ile katı LB orta Agrobacterium rhizogenes MSU440 büyümek.
Steril bir neşter kullanarak, radicle ve domates fidelerinin hipokotil alt kesti. LB ortamının yüzeyinden A.rhizogenes biyokütlesi hasat etmek için plastik uçlar veya neşter bıçak kullanın ve dikkatlice bakteriyel biyokütle kesilmiş domates fideleri daldırma. Bundan sonra, yüksek nem tutmak ve hayatta kalma ve yeni kök gelişimini kolaylaştırmak için iki santimetre-dört santimetre yarım daire filtre kağıdı ile domates fideleri kapağı.
Fidelerin transpirasyona izin veren bir ortamda yüksek nemde tutulması önemlidir. Bunu yapmak için, filtre kağıdı ile fideler kapağı ve Micropore bant ile plaka kapatın. Dönüştürülmüş domates fidelerini 25 ila 28 santigrat derece arasında bir büyüme odasında altı ila yedi gün saklayın.
Sonra yeni ortaya çıkan tüylü kökleri kesmek için steril bir neşter kullanın, ve fideler yeni tüylü kökleri üretmek için izin. İkinci nesil yeni tüylü kökler göründükten sonra, fidelerin üstündeki filtre kağıdını çıkarın ve plakayı tekrar Mikropore bandıyla kapatın. DsRed floresansını veya in vivo görüntüleme tesisi için başka herhangi bir ekipmanı görselleştirmek için, kırmızı floresan tarafından tanımlanabilen pozitif dönüştürülmüş kökleri işaretleyin.
Kırmızı floresan eksikliği ile tespit edilebilir negatif olmayan dönüşümolmayan kökleri kaldırmak için bir neşter kullanın. Ana kök olarak dönüştürülmüş kökün gelişimini kolaylaştırmak için kırmızı floresan gösteren fideleri yarı mukavemetli Murashige ve Skoog ortamı içeren yeni bir tabağa aktarın. Daha sonraki zaman noktalarında floresan köklerin ortaya çıkışını kontrol etmek için aynı plaka içinde kırmızı floresan göstermeyen fideler tutun.
Fidelerin üzerini iki santimetreye dört santimetrelik yarım daireşeklinde bir filtre kağıdıyla kapatın, tabağı kapatın ve yeni kıllı kökler geliştirmeleri için fideleri kuluçkaya yatırın. Köklerin yüzeyinin ilk olarak aşı kaplarını suyla ıslatarak, fazla su dökerek ve plastik bir ekim tepsisine koyarak bakteriin yüzeyine maruz kalacakları aşı kaplarını hazırlayın. Cımbız kullanarak, dönüştürülmüş kökleri ile seçilen fideler aşılama kapları aktarın.
Tepsiyi plastik bir sargı veya şeffaf bir kapakla kaplayın ve %65 nem oranıyla 25 ila 28 santigrat derecede tutun. Beş ya da altı gün sonra kapağı çıkarın. 28 santigrat derece bir orbital shaker beş LB sıvı ortamda Ralstonia büyümek, 200 rpm sallayarak, sabit faza kadar.
Bakteri sayılarını belirlemek için optik yoğunluğu 600 nanometre olarak ölçün. 1 OD600 su ile bakteri kültürünü seyreltin. Dönüştürülmüş domates bitkilerini içeren 16 ila 20 aşı kabını aşı tepsisine yerleştirin.
Sonra tepsiye seyreltilmiş bakteriyel inoculum 300 mililitre dökün ve bitkilerin 20 dakika boyunca inoculum emmek için izin verin. Bundan sonra, çömlekçilik toprak tabakası ile yeni bir tepsi hazırlayın. Aşılanmış kapları yeni tepsiye taşıyın ve tepsileri %75 nem, 26 ila 28 derece arasında bir sıcaklık ve 12 saatlik ışık ve 12 saatlik karanlık bir fotoperiile bir büyüme odasına yerleştirin.
Burada, domates kökleri dönüştürülür ve bakteriyel solgunluk hastalığı nın çalışması için basit genetik analiz yapmak için Ralstonia ile aşılanır. Hastalık belirtilerinin gelişimi boş bir vektör ile dönüştürülmüş kökleri ile domates bitkileri ve domates CESA6 hedefleyen bir RAI yapı ile dönüştürülmüş olanlar izlenir. Hastalık indeksi verileri, zaman içinde aynı deneysel birimden sıfırdan dörde kadar rasgele bir ölçeğe göre toplanır ve parametrik veriler için standart testlerin kullanımını göz ardı eden Gaussian dağılımını takip etmez.
Standart bir yaklaşım olarak, bir U Mann-Whitney, iki kuyruklu, parametrik olmayan test hem kontrol ve enfeksiyon eğrileri karşılaştırmak için kullanılır. Bu analize göre, her iki eğrinin ortancaları arasındaki fark önemsiz gibi görüner. Ayrıca hastalık ilerleme eğrisi altında alan ölçmek mümkündür, hangi tek bir değer de hastalık ilerleme birden fazla gözlem birleştirerek sağlar.
Hastalık ilerleme eğrisi altında alan, enfeksiyon sürecinin sonunda domates CESA6 RNAi bitkilere göre kontrol tesisleri için daha yüksek bir değer gösterir, domates CESA6 susturulan bitkiler kontrol tesisleri daha Ralstonia enfeksiyonuna karşı daha dayanıklı olduğunu gösteren. Güven aralıkları, yüksek olasılıkla, belirli bir değişkenin popülasyon değerinin bulunduğu bir değer aralığını tahmin etmenin bir yolunu sunar. Burada görüldüğü gibi, kontrol ve enfeksiyon eğrileri için%95 güven aralığının alanı, CESA6 susturulduğunda daha yüksek bir direnç şansı tahmin eder.
Hastalık indeksi değerleri, sıfıra karşılık gelen ikiden daha düşük bir hastalık indeksi ve bire karşılık gelen ikiden daha yüksek bir hastalık indeksi göz önüne alındığında ikili veriye dönüştürülebilir. Bu Ralstonia aşısı sonrası bir sağkalım eğrisi temsilsağlar. Gehan-Breslow-Wilcoxon istatistiksel testine göre kontrol ve enfekte bitkiler arasındaki sağkalım oranı arasındaki farklılıklar istatistiksel olarak anlamlı değildir.
CESA6'nın ekspresyonu, aşılama adımından önce rastgele seçilmiş iki kökte analiz edilir ve Ralstonia'ya karşı gelişmiş direncin CESA6'nın azaltılmış ifadesi ile ilişkili olduğunu gösterir. İki seçim turundan sonra ,%35-40 arasında bir dönüşüm oranı elde edilebilir ve bu değer ek seçim turları gerçekleştirilerek artırılabilir. Bu işlemi gerçekleştirirken, fidelerin yüksek nemi korumak için bir filtre kağıdı parçasıyla kaplı tutulması ve gaz değişimini sağlamak için plakaların Mikropore ile mühürlemesi önemlidir.
Kök dönüşümünden sonra, tedavilerin çoğu kök fizyolojisi gözlem veya moleküler biyoloji, hücre biyolojisi veya biyokimya kullanarak bitki yanıtı çalışma için uygulanabilir. Esas olarak, bu teknik sınırlı kaynaklara sahip araştırmacılar domates kökleri bakteriyel enfeksiyon genetik analizi gerçekleştirmek için izin verecektir.
