Митохондриальная дисфункция лежит в основе многих нейродегенеративных заболеваний. Наш протокол является важным инструментом для изучения митохондриальной динамики в аксонах, облегчая изучение неврологических заболеваний, связанных с аксональной дегенерацией. Комбинируя митохондриальную маркировку, живую клеточную визуализацию и индуцированную плюрипотентную технологию стволовых клеток, наш протокол может быть использован для характеристики митохондриальной торговли вдоль человеческих аксонов и для анализа их морфологий.
Нарушение митохондриального транспорта и морфологии можно наблюдать в культурах стволовых клеток и животных моделях нейродегенеративных заболеваний, обеспечивающих потенциальные терапевтические цели для лечения этих заболеваний. После дня тридцать пять культуры, разъедижевать нейросферы дифференцированы от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в небольших кластеров с 1 мг / мл клеточного раствора отряда в течение двух минут при 37 градусов по Цельсию. В конце инкубации собирайте клеточные кластеры путем центрифугации и повторно посовекуйте гранулы в один миллилитр NDM.
Плита около пяти кластеров клеток в сто микролитров среднего на полиорнитин и лактозы дегидрогеназы подъема вирус-бесплатно снижение фактора роста мембраны мембраны матрицы покрыты 35 миллиметров стеклянной нижней посуды. Затем добавьте один миллилитр NDM, дополненный B27, циклическим аденозин-монофосфатом, инсулиноподобным фактором роста, нейротрофическим фактором, полученным мозгом человека, и нейротрофическим фактором, полученным из глиальных клеток, к каждой культуре. Чтобы визуализировать митохондрии вдоль аксонов нейронов forebrain первый пятно нейронов с 50 наномолярного красного флуоресцентного красителя в NDM в течение трех минут при 37 градусов по Цельсию, а затем два моет в теплой NDM.
Далее поместите культуру на сцену флуоресцентный микроскоп и выберите цель 40X. Под фазово-полем идентифицируют аксоны на основе их морфологических характеристик. Для различения направления митохондриального движения вдоль аксонов четко идентифицируются клеточные тела нейронов.
После различения клеточного тела и аксона корректировать время экспозиции и фокус митохондрий в аксонах и захватывать митохондриальный транспорт в аксонах каждые пять секунд в общей сложности пять минут. Для анализа митохондриального транспорта в ImageJ откройте Фиджи и выберите плагин Bio-Formats. Используйте импортера Bio-Formats для импорта временных изображений серии tiff и выбора стандартных ImageJ и Open всех серий.
Проверьте автоматические раздельные каналы и нажмите OK, чтобы отметить количество кадров и размер изображений в пикселях. После регулировки яркости и контрастности для всех 60 кадров используйте сегментированную линию, чтобы провести линию от тела ячейки до терминального аксона. Для создания Kymograph выберите несколько плагинов Kymograph и выберите ширину линии.
Для измерения расстояния, значений времени и скорости для движущихся митохондрий откройте tsp050607. txt в плагине макросов. И нарисуйте сегментированную линию над следом митохондриального движения на кимографе от начальника к низшей области.
После рисования линии открыты скорости чтения из чайной ложки в плагине макросов, чтобы прочитать сегментированные скорости, соответствующие линии. Затем откройте исходное изображение и используйте линейный инструмент, чтобы нарисовать линию вдоль бара масштаба. Выберите анализ для измерения длины линии и преобразования dx сейчас и единиц расстояния от пикселей до микрометров.
Затем измените время от пикселя к секундам. Для анализа митохондриальной длины и области в аксонах в ImageJ установите выпрямительную точку плагина JAR и откройте интересное изображение аксона. Преобразуй 32-битное изображение в восемь битов и используйте инструмент сегментированных линий для отслеживания аксона.
Выберите плагин Straighten underscore JAR и установите ширину линии шириной нити до 50 пикселей. Отслеживайте аксон снова, чтобы создать выпрямленный аксон и настроить порог изображения. Выберите анализ набора измерений периметра подходят эллипсы и формы дескрипторов для настройки измерения и использовать функцию линии для измерения шкалы бар в исходном изображении, как попродемонстрировано.
При анализе и настройке шкалы введите расстояние в пикселях известное расстояние и единицу длины для настройки шкалы. Затем выберите глобальную, чтобы установить параметр масштаба для всех изображений. Наконец, выберите анализ и анализ частиц для определения области и выбора результатов отображения для просмотра полученного измерения.
После дифференциации в теленцефалических глутаматергических нейронов клетки могут быть охарактеризованы их T-B-R один и бета три тубулина маркер выражения. Окрашивание красным флуоресцентным красителем и покадровая визуализация позволяют оценку аксонального транспорта митохондрий. Один митохондрион может оставаться статичным или двигаться в антероградном или ретроградном направлении в аксоне.
Скорость митохондриального движения вдоль аксона можно количественно оценить как проиллюстрированную. Например, с помощью коммерчески доступного программного обеспечения анализа процент пестрых митохондрий значительно снижается в S-P-G-3-A нейронов по сравнению с дикими нейронами типа. Для анализа длины митохондриальной области и соотношения сторон аксоны могут выпрямиться в программном обеспечении анализа изображений и выбраны путем корректировки порога.
Затем из выпрямленного аксона можно получить митохондриальную ширину периметра и соотношение сторон. Например, как митохондриальная длина, так и соотношение сторон значительно уменьшены в аксонах нейронов S-P-G 15 по сравнению с контрольом аксонов дикого типа. Важно, чтобы согреть среды и микроскоп инкубатор мыть клетки мягко и позволить клеткам стабилизироваться в течение двадцати минут до изображения.
После живой клеточной визуализации культуры могут быть исправлены и подвергнуты иммуностеинированию для изучения экспрессии других белков, представляющих интерес. Трудно изучить митохондриальную динамику в живых человеческих нервах. Этот метод обеспечивает уникальный инструмент для изучения митохондриальной динамики и дегенерации нервов при неврологических заболеваниях.
