La disfunción mitocondrial subyace a muchas enfermedades neurodegenerativas. Nuestro protocolo proporciona una herramienta importante para examinar la dinámica mitocondrial en los axones, facilitando el estudio de enfermedades neurológicas que implican la degeneración axonal. Mediante la combinación de etiquetado mitocondrial, imágenes de células vivas y tecnología de células madre pluripotentes inducidas, nuestro protocolo se puede utilizar para caracterizar el tráfico mitocondrial a lo largo de los axones humanos y analizar sus morfologías.
El transporte mitocondrial deteriorado y la morfología se pueden observar en cultivos con células madre y modelos animales de enfermedades neurodegenerativas que proporcionan posibles dianas terapéuticas para el tratamiento de estas enfermedades. Después del año treinta y cinco de cultivo, disociar las neuroesferas diferenciadas de las células madre pluripotentes inducidas por el ser humano en pequeños racimos con 1 mg/ml de solución de desprendimiento celular durante dos minutos a 37 grados centígrados. Al final de la incubación recoger los cúmulos celulares por centrifugación y resuspend el pellet en un mililitro de NDM.
Placa de unos cinco grupos de células en cien microlitros de medio por poliornitina y lactosa deshidrogenasa elevando la matriz de membrana de sótano de factor de crecimiento reducido libre de virus recubierta 35 milímetros de vidrio platos inferiores. Luego agregue un mililitro de NDM complementado con B27, monofosfato de adenosina cíclico, factor de crecimiento insulina-like, factor neurotrófico derivado del cerebro humano y factor neurotrófico derivado de células gliales a cada cultivo. Para visualizar las mitocondrias a lo largo de los axones de las neuronas del antebrado, primero manchar las neuronas con 50 nanomolares rojos fluorescentes en NDM durante tres minutos a 37 grados Celsius seguido de dos lavados en NDM caliente.
A continuación, coloque el cultivo en el escenario de un microscopio de fluorescencia y seleccione el objetivo 40X. En el campo de fase, identifique los axones en función de sus características morfológicas. Para distinguir la dirección del movimiento mitocondrial a lo largo de los axones identificar claramente los cuerpos celulares de las neuronas.
Después de distinguir el cuerpo celular y el axón, ajuste el tiempo de exposición y el enfoque de las mitocondrias en los axones y capture el transporte mitocondrial dentro de los axones cada cinco segundos durante un total de cinco minutos. Para analizar el transporte mitocondrial en ImageJ, abra Fiji y seleccione el plugin Bio-Formats. Utilice el importador de biotemos para importar las imágenes de lapso de tiempo de la serie tiff y seleccione las series estándar ImageJ y Open all.
Compruebe la escala automática de canales divididos y haga clic en Aceptar teniendo cuidado de anotar el número de fotograma y el tamaño de las imágenes en píxeles. Después de ajustar el brillo y el contraste de los 60 fotogramas, utilice la línea segmentada para dibujar una línea desde el cuerpo de la celda hasta el axón terminal. Para generar el Kymograph seleccione el plugin Kymograph múltiple y seleccione el ancho de línea.
Para medir la distancia, los valores de tiempo y la velocidad de las mitocondrias móviles abiertas tsp050607. txt en el plugin macros. Y dibuje una línea segmentada sobre el rastro del movimiento mitocondrial en el cifógrafo de la región superior a inferior.
Después de dibujar la línea abierta leer velocidades de tsp en el plugin macros para leer las velocidades segmentadas correspondientes a la línea. A continuación, abra la imagen original y utilice la herramienta de línea para dibujar una línea a lo largo de la barra de escala. Seleccione analizar para medir la longitud de la línea y convertir el dx ahora y las unidades de distancia de píxeles a micrómetros.
A continuación, cambia el tiempo de píxel a segundo. Para analizar la longitud mitocondrial y el área dentro de los axones en ImageJ, instale el plugin JAR de punto de subrayado enderezar y abra la imagen de axón de interés. Convierta la imagen de 32 bits a ocho bits y utilice la herramienta de línea segmentada para trazar el axón.
Seleccione el plugin JAR de subrayado Straighten y establezca el ancho de la línea ancha del filamento en 50 píxeles. Trace el axón de nuevo para generar un axón enderezado y ajustar el umbral de la imagen. Seleccione analizar los descriptores de elipse y forma de ajuste perimetral de medidas de conjunto para establecer la medida y utilizar la función de línea para medir la barra de escala en la imagen original como se ha demostrado.
En Analizar y establecer la escala, introduzca la distancia en píxeles de distancia conocida y la unidad de longitud para establecer la escala. A continuación, seleccione global para establecer la configuración de escala en todas las imágenes. Finalmente seleccione analizar y analizar partículas para determinar el área y seleccione los resultados de visualización para ver la medición resultante.
Después de la diferenciación en neuronas glutamatérgicas telencéfalas las células se pueden caracterizar por su T-B-R uno y beta tres expresión marcador de tubulina. La tinción con tinte fluorescente rojo y lapso de tiempo permite evaluar el transporte axonal de las mitocondrias. Un solo mitocondrión puede permanecer estático o moverse en una dirección anterograda o retrógrada dentro de un axón.
La velocidad del movimiento mitocondrial a lo largo del axón se puede cuantificar como se ilustra. Por ejemplo, el uso de software de análisis disponible comercialmente el porcentaje de mitocondrias móviles se reduce significativamente en las neuronas S-P-G-3-A en comparación con las neuronas de tipo salvaje. Para analizar la longitud del área mitocondrial y la relación de aspecto axones se pueden enderezar en el software de análisis de imágenes y seleccionar mediante el ajuste del umbral.
La anchura de la longitud perimetral del área mitocondrial y la relación de aspecto se pueden obtener a partir del axón enderezado. Por ejemplo, tanto la longitud mitocondrial como la relación de aspecto se reducen significativamente en los axones de neuronas S-P-G 15 en comparación con los axones de tipo salvaje de control. Es importante calentar el medio y la incubadora del microscopio para lavar las células suavemente y permitir que las células se estabilicen durante veinte minutos antes de la toma de imágenes.
Después de las imágenes de células vivas, los cultivos pueden ser fijos y sometidos a inmunosuchación para examinar la expresión de otras proteínas de interés. Es difícil examinar la dinámica mitocondrial en los nervios humanos vivos. Esta técnica proporciona la herramienta única para el estudio de la dinámica mitocondrial y la degeneración nerviosa en la enfermedad neurológica.
