A disfunção mitocondrial está por trás de muitas doenças neurodegenerativas. Nosso protocolo fornece uma importante ferramenta para examinar a dinâmica mitocondrial nos axônios, facilitando o estudo de doenças neurológicas envolvendo degeneração axonal. Combinando rotulagem mitocondrial, imagens de células vivas e tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas, nosso protocolo pode ser usado para caracterizar o tráfico mitocondrial ao longo de axônios humanos e para analisar suas morfologias.
O transporte mitocondrial prejudicado e a morfologia podem ser observados em culturas de células-tronco e modelos animais de doenças neurodegenerativas que fornecem potenciais alvos terapêuticos para o tratamento dessas doenças. Após o dia trinta e cinco da cultura, dissociar as neurosferas diferenciadas das células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem em pequenos aglomerados com 1 mg/ml de solução de descolamento celular por dois minutos a 37 graus Celsius. No final da incubação, colete os aglomerados celulares por centrifugação e resuspense a pelota em um mililitro de NDM.
Placa de cerca de cinco aglomerados de células em cem microlitadores de médio por poliornitina e lactose desidrogenase elevando a matriz de membrana do porão do fator de crescimento reduzido sem vírus revestida de pratos inferiores de vidro de 35 milímetros. Em seguida, adicione um mililitro de NDM suplementado com B27, monofosfato de adenosina cíclica, fator de crescimento semelhante à insulina, fator neurotrófico derivado do cérebro humano e fator neurotrófico derivado de células glia a cada cultura. Para visualizar mitocôndrias ao longo dos axônios dos neurônios do cérebro primeiro mancham os neurônios com 50 corantes fluorescentes vermelhos nanomolar em NDM por três minutos a 37 graus Celsius seguidos por duas lavagens no NDM quente.
Em seguida, coloque a cultura no palco de um microscópio de fluorescência e selecione o objetivo 40X. Sob o campo de fase identificar os axônios com base em suas características morfológicas. Para distinguir a direção do movimento mitocondrial ao longo dos axônios identificar claramente os corpos celulares dos neurônios.
Depois de distinguir o corpo celular e o axônio ajustar o tempo de exposição e o foco das mitocôndrias nos axônios e capturar o transporte mitocondrial dentro dos axônios a cada cinco segundos por um total de cinco minutos. Para analisar o transporte mitocondrial no ImageJ abra Fiji e selecione o plugin Bio-Formats. Use o importador Bio-Formats para importar as imagens de lapso de tempo da série tiff e selecione ImageJ padrão e Abra todas as séries.
Verifique os canais divididos em escala automática e clique em OK tomando cuidado para observar o número do quadro e o tamanho das imagens em pixels. Depois de ajustar o brilho e o contraste para todos os 60 quadros use a linha segmentada para desenhar uma linha do corpo celular para o axônio terminal. Para gerar o Kymograph selecione o plugin kymograph múltiplo e selecione a largura da linha.
Para medir a distância, os valores de tempo e a velocidade para as mitocôndrias em movimento abrem tsp050607. txt no plugin de macros. E desenhar uma linha segmentada sobre o traço do movimento mitocondrial no kymograph do superior à região inferior.
Depois de desenhar a linha aberta leia velocidades de tsp no plugin de macros para ler as velocidades segmentadas correspondentes à linha. Em seguida, abra a imagem original e use a ferramenta de linha para desenhar uma linha ao longo da barra de escala. Selecione analisar para medir o comprimento da linha e converter o dx agora e as unidades de distância de pixels para micrômetros.
Em seguida, mude o tempo de pixel para segundos. Para analisar o comprimento mitocondrial e a área dentro dos axônios no ImageJ instale o plugin ponto de ponto dot ponto e abra a imagem de interesse do axônio. Converta a imagem de 32 bits em oito bits e use a ferramenta de linha segmentada para rastrear o axônio.
Selecione o plugin JAR de sublinhar o straighten e defina a largura da linha de linha larga de filamentos para 50 pixels. Rastreie o axônio novamente para gerar um axônio endireitado e ajuste o limiar da imagem. Selecione analisar as medidas do perímetro e os descritores de forma para definir a medição e use a função de linha para medir a barra de escala na imagem original, conforme demonstrado.
Em análise e para definir a escala, entre a distância em pixels de distância conhecida e a unidade de comprimento para definir a escala. Em seguida, selecione global para definir a configuração de escala para todas as imagens. Por fim, selecione analisar e analisar partículas para determinar a área e selecione os resultados de exibição para visualizar a medição resultante.
Após a diferenciação em neurônios glutamatericos telenceráféricos, as células podem ser caracterizadas por sua expressão de marcador de t-B-R e beta três tubulin. A coloração com corante fluorescente vermelho e imagens de lapso de tempo permite a avaliação do transporte axonal de mitocôndrias. Um único mitocôndria pode permanecer estático ou mover-se em uma direção anterograda ou retrógrada dentro de um axônio.
A velocidade do movimento mitocondrial ao longo do axônio pode ser quantificada como ilustrado. Por exemplo, usando software de análise comercialmente disponível, a porcentagem de mitocôndrias motile é significativamente reduzida em neurônios S-P-G-3-A em comparação com neurônios do tipo selvagem. Para analisar o comprimento da área mitocondrial e os axônios de proporção podem ser endireitados no software de análise de imagem e selecionados ajustando o limiar.
A largura de comprimento do perímetro da área mitocondrial e a proporção de aspecto podem então ser obtidas a partir do axônio endireitado. Por exemplo, tanto o comprimento mitocondrial quanto a proporção são significativamente reduzidos em axônios neurônios S-P-G 15 em comparação com o controle de axônios do tipo selvagem. É importante aquecer o meio e a incubadora de microscópio para lavar as células suavemente e permitir que as células se estabilizem por vinte minutos antes da imagem.
Após a imagem de células vivas, as culturas podem ser fixadas e submetidas a imunostendantes para examinar a expressão de outras proteínas de interesse. É desafiador examinar a dinâmica mitocondrial em nervos humanos vivos. Esta técnica fornece a ferramenta única para o estudo da dinâmica mitocondrial e degeneração nervosa em doenças neurológicas.
