פרוטוקול זה נועד להשתמש אורגנוידים במוח כדי לחקור מחלות מיטוכונדריאליות. הוא פותח ליצירת אורגנוידים במוח לשחזור בהערכת תכונות המיטוכונדריה שלהם. שיטה זו אינה דורשת ביו-רה-קטרים יקרים והליכי הטמעה גוזלי זמן.
לכן, קל ליישם ויוקרתי. פרוטוקול זה מאפשר ליצור אורגנוידים במוח לשחזור ולבדוק את תכונות המיטוכונדריה שלהם. זה יכול להוביל לזיהוי של מטרות התערבותיות למחלות מיטוכונדריה בלתי ניתנות לטיפול.
בתור התחלה, תרבות IPSCs אנושי בתנאים ללא הזנה ב- iPSC בינוני על צלחות מצופות שש בארות ולשמור אותם בחממה תרבית רקמות לחה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. מעבר IPSCs ב 80% conencency באמצעות מדיום ניתוק ללא אנזימים ביחסים הנעים בין אחד על ארבעה לאחד על 12. כדי להגביר את הישרדות התא, להוסיף 10 מיקרומולר הקשורים רו חלבון קינאז או מעכב ROCK לאחר כל פיצול.
נתק את 80% iPSCs ביום אפס. הכן הבחנה קליפת המוח בינוני אחד או CDM1 מראש לחמם אותו בטמפרטורת החדר לפני הוספתו לתאים. לשטוף את הבארות המכילות את iPSCs עם PBS כדי להסיר תאים מתים ופסולת.
הוסיפו 500 מיקרוליטרים של ריאגנט A מחומם מראש לכל באר ודגרו במשך חמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס. בדוק מתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח ניתוק תאים. הוסף מיליליטר אחד של iPSC בינוני כדי לדלל reagent A כדי לנטרל את פעילותה.
השתמש 1,000 צנרת מיקרוליטר כדי לנתק את התאים על ידי צנרת למעלה ולמטה ולהעביר את ההשעיה התא לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. צנטריפוגות בעדינות IPSCs ב 125 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן בזהירות לשאוף supernatant כדי למנוע הפרעה גלולה התא. resuspend הכדור עם מיליליטר אחד של CDM1 כדי לקבל השעיה תא יחיד ולספור את מספר התא.
הכן את מדיום הזריעה עם 9, 000 iPSCs לכל 100 מיקרוליטרים ב- CDM1 בתוספת מעכב רוק מיקרומולרי 20, שלושה מעכבי קטנין WNT מיקרומולרי או IWR-1, וחמישה מיקרומולרים SB-431542. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של מדיום זריעה לבאר לצלחת תחתונה V של 96 באר. שמור את הצלחת באינקובטור תרבית רקמות לחה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.
כדי ליצור נוירוספרות, ביום הראשון, שימו לב שצבירת תאים עגולים עם גבולות חלקים מוגדרים נוצרים. שים לב לתאים המתים סביב האגרגטים. המשך לתרבות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.
ביום השלישי, להסעיר את הצלחת על ידי הקשה על הצדדים שלוש פעמים כדי לנתק תאים מתים, ולאחר מכן להוסיף 100 microliters של CDM1 בתוספת 20 מעכבי ROCK מיקרומולרי, שלושה IWR-1 מיקרומולרי, וחמישה מיקרומולרים SB-431542 לכל באר. שמור את הצלחת לאינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. ביום השישי, הסר בזהירות 80 מיקרוליטרים של המדיום העל-טבעי מכל באר.
הימנעו מלגעת בתחתית הבאר. הוסף 100 מיקרוליטרים של CDM1 בתוספת שלושה מיקרומולרים IWR-1 וחמישה מיקרומולרים SB-431542 לכל באר ודגרת הצלחת. חזור על השלב הקודם לאחר כל שלושה ימים עד יום 18.
ביום 18, כדי להעביר נוירוספרות, להכין CDM2 ולהוסיף 10 מיליליטר ללוח תרבית תא חיבור נמוך במיוחד 100 מ"מ. השתמש פיפטה 200 microliter עם קצה מנותק כדי להעביר את הנוירוספרות העגולות מהצלחת 96-well ללוח תרבית תא 100 מילימטר נמוך במיוחד. הסר חמישה מיליליטר של בינוני מהצלחת המכילה את הנוירוספירות ולהוסיף חמישה מיליליטר של CDM2 טרי.
מניחים את הלוח על שייקר מסלולית ב 70 סיבובים לדקה בתוך אינקובטור תרבית רקמות לח ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. כל שלושה ימים, שאפו בזהירות את המדיום העל-טבעי והחליפו אותו ב-CDM2 טרי. השאירו כמות קטנה של המדיום כדי למנוע נוירוספרות להתייבש.
ביום ה-35, הכינו את CDM3. שואפים את המדיום מהצלחת ומוסיפים 10 מיליליטר של CDM3 קר. לאחר שינוי המדיום, מניחים את הלוח בחזרה על שייקר מסלולית ב 70 סיבובים לדקה בתוך אינקובטור תרבות רקמות לח ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.
שנה את המדיום כל שלושה עד חמישה ימים בהתאם לקצב הצמיחה כפי שצוין על ידי צבע המדיום. ביום ה-70, הכינו את CDM4. השתמש CDM4 בינוני עד הגיל הרצוי של organoids הוא הגיע.
במהלך תקופה זו, לשמור את הלוח על שייקר מסלולית להגדיר ב 70 סיבובים לדקה בתוך אינקובטור תרבות רקמות לח ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. שנה את המדיום כל שלושה עד חמישה ימים בהתאם לקצב הצמיחה. הכן פתרון 4%PFA והצב אותו מתחת למכסה בטיחות.
לאסוף organoids המוח בעדינות להעביר אותם עם פיפטה פסטר פלסטיק 3 מיליליטר קהה לצלחת שש באר מלא PFA. שמור את האורגנוידים בתמיסת PFA למשך שעה בטמפרטורת החדר. הסר בזהירות את PFA עם פיפטה פסטר פלסטיק שלושה מיליליטר ולשטוף את organoids קבוע שלוש פעמים באמצעות PBS.
יש לאחסן את האורגנוידים הקבועים בארבע מעלות צלזיוס ב-PBS עד לשימוש נוסף. האורגנוידים הנוצרים באמצעות פרוטוקול זה מכילים נוירונים בוגרים שניתן לדמיין באמצעות סמני חלבון ספציפיים לאקסונים ודנדריטים. organoids בוגר מכילים לא רק תאים עצביים, אלא גם תאי גליה.
באמצעות ניתוח אורגנוידים במוח פרוס, ניתן לפקח על אקסונים חיוביים SMI 312 ו- MAP2 דנדריטים חיוביים או תאי גליית בטא S100. יתר על כן, תמונות קונפוקליות לעזור לחקור את ההפצה המפורטת וארגון של אבות עצביים חיוביים SOX2 ביחס נוירונים חיוביים בטא-3 טובולין. אורגנוידים במוח היו מוכתמים עבור סמנים ספציפיים למיטוכונדריה, כגון translocase של הממברנה החיצונית או TOM20.
פרופיל ביו-אנרגטי של אורגנוידים במוח בוצע על ידי מדידת חילוף החומרים המיטוכונדריאלי באמצעות קצב צריכת החמצן, או OCR, ואת חילוף החומרים הגליקוליטי באמצעות קצב החמצה חוץ תאית, או ECAR. אוליגומיצין גורם לירידה בפרופיל זיהוי האופטי (OCR) ולכן מזהה את זיהוי האופטי (OCR) הדרוש לייצור ATP. על טיפול אוליגומיצין, ייתכן גם עלייה מפצה ECAR מציע כי התאים יכולים upregulate גליקוליזה כדי למנוע את הלחץ המטבולי.
בעת העברת הנוירוספרות מהצלחת 96-באר ללוח תרבות או במהלך הליך התיקון, חשוב לטפל באורגנוידים בעדינות כדי למנוע פגיעה בהם. בעקבות הדור של organoids המוח, מערך רב אלקטרודה או הדמיית סידן יהיה שיטות אידיאליות כדי לבדוק את הפונקציונליות של organoids.
