פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לסנן ספריות lentiviral או רטרו-ויראלי כדי לזהות וסתים חדשים של גורמי שעתוק בתאים סרטניים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא מהירה, תפוקה בינונית וזולה, והיא משתמשת בציוד ובריגנטים הנגישים לרוב החוקרים. כדי להרחיב ולטהר כל וקטור lentiviral בספרייה, תחילה להוסיף 1.3 מיליליטר של מרק לוריא בתוספת 100 מיקרוגרם למיליליטר של אמפיצילין לכל באר של צלחת באר עמוקה 96 היטב.
לחסן כל באר עם שני microliters של מלאי גליצרול עבור דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 225 מהפכות לדקה. למחרת, להעביר כל תרבות חיידקים לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה בודדים 1.5 מיליליטר עבור צנטריפוגה. לטהר כל וקטור עם ערכת miniprep חיידקי מתאים על פי הוראות היצרן.
עבור כל וקטור בספרייה המוכנה, זרע באר אחת של צלחת 24 באר עם אחד 10 עד החמישי 293FT תאים דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 24 שעות. כדי להכין תערובת transfection אשר יוגדר עבור כל וקטור בספרייה, תחילה לרחף כל וקטור lentiviral לריכוז סופי של 50 ננוגרם למיקרוליטר עם מים ללא גרעין. העבר חמישה מיקרוליטרים של כל דילול לתוך בארות בודדות של צלחת PCR 96 היטב.
הפוך תערובת סופר transfection על ידי ערבוב 1.25 microliters פעמים x של reagent transfection אחד עם 23.75 microliters פעמים x של מאגר transfection מחומם מראש. דגירה סופר transfection לערבב בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן להוסיף 125 ננוגרם פעמים x של psPAX2 ו 125 ננוגרם פעמים x של VSVG לתערובת סופר עם צינורות עדינים.
מיד aliquot את תערובת סופר לתוך כל צינור של רצועת PCR ולהשתמש פיפטה רב ערוצית להעביר 25 microliters של התערובת לתוך כל באר של וקטור ויראלי מדולל. לאחר דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר, השתמשו בפיפטה רב-ערוצית כדי להעביר 30 מיקרוליטרים של כל תערובת החלפה מכל באר לתוך באר תואמת של תאי 293FT בצלחת 24 הבאר שהוכנה בעבר. להחגירה את התאים במשך 24 שעות לפני החלפת המדיום בכל באר עם 500 microliters של מדיום צמיחה שלם טרי עבור דגירה נוספת 24 שעות ביממה באינקובטור תרבות התא.
למחרת, השתמשו בפיגט רב-ערוצי כדי לאסוף את העל-טבעי הוויראלי מכל באר ו-220 מיקרוליטרים של כל על-טבעי לשתי בארות בצלחת חדשה של 96 בארות כדי ליצור צלחת על-טבעית ויראלית ערוך. כדי להכין תאים A375 לזיהום, זרע פעם אחת 10 לתאים החמישיים בצלחת 24 באר ב 0.5 מיליליטר של מדיום צמיחה מלאה לגם עבור כל וקטור ויראלי בספרייה. כלול באר נוספת שלא תהיה נגועה כדי לשמש שליטה לבחירת תרופות.
לאחר אינקובציה של 24 שעות באינקובטור תרבות התא, להפשיר את על טבעי lentiviral ערוך קפוא להגדיר לטמפרטורת החדר לפני החלפת מדיום הצמיחה מכל באר של צלחת תרבות התא מוכן עם 200 microliters של מדיום צמיחה בתוספת 20 מיקרוגרם למיליליטר של פוליברין. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, מעבירים 200 מיקרוליטרים של על-טבעי ויראלי מכל 96 בארות לכל באר של צלחת 24 בארות. מחזירים את התאים לאנקובטור תרבות התאים למשך 24 עד 48 שעות.
בסוף האינקובציה, להחליף את המדיום בכל באר עם 500 microliters של מדיום צמיחה בתוספת puromycin ולהחזיר את התאים החממה תרבות התא במשך 48 שעות נוספות. לאחר בחירת puromycin 48 שעות, למיין את התאים לשלוש או ארבע קבוצות, כך שכל הבארות בקבוצה אחת יש צפיפות תא דומה ולהוסיף 200 microliters של טריפסין-EDTA לנציג אחד גם מכל קבוצה עבור דגירה של חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר התאים התנתקו, לנטרל את טריפסין עם 400 microliters של מדיום צמיחה בתוספת puromycin ולספור את מספר התאים מכל טריפסין היטב.
לדלל כל מתלה תא פעמיים 10 לתאים החמישיים לריכוז מיליליטר עם מדיום צמיחה בתוספת puromycin וזרע 500 microliters של תאים מכל באר לתוך אותה גם מיקום בצלחת חדשה 24 באר. לאחר שימוש בספירות מכל נציג היטב כדי להעריך את מספר התא בכל באר שנותרה בכל קבוצה, הוסף את הנפח המתאים של טריפסין-EDTA לכל באר כדי להשיג 10 פעמים עד התא השישי לריכוז מיליליטר. במהלך טריפסיניזציה, להשתמש פיפטה רב ערוצית להוסיף 400 microliters של בינוני צמיחה בתוספת puromycin ל בארות המתאימות המתאימות בצלחת החדשה 24 היטב.
לאחר שתאים התנתקו, מערבבים בעדינות את התוכן של כל באר ומעבירים 100 מיקרוליטרים של כל מתלה תא ל הבאר המתאימה המתאימה בצלחת החדשה של 24 בארות. ואז להחזיר את התאים לאנקובטור תרבות התא במשך 24 שעות. כדי לשנות את התאים עם מבנה הכתב כפול לוציפראז, להכין את תערובת דילול transfection כפי שצוין בטבלה.
כדי להכין את תערובת דילול הכתב, מערבבים את הכרכים של כל רה"מ מוכפל במספר הכולל של transfections בתוספת מספר כרכים נוספים. לאחר מכן, מערבבים את תערובת דילול ההטרמפקט עם תערובת דילול הכתבים ומדגרים את הפתרון שנוצר בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות כדי לייצר את תערובת ההטרנספיה. במהלך הדגירה, לשטוף כל באר של צלחת תרבות התא עם 250 microliters של PBS ולהוסיף 447 microliters של מדיום צמיחה מלאה טרי לכל באר.
לאחר מכן השתמש פיפטה רב ערוצית להפיץ 53 microliters של תערובת transfection לכל באר של צלחת תרבות התא. מניחים את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 24 שעות. כדי למדוד את פעילות luciferase, לדלל חיץ תזה פסיבי 5X מערכת פעילות luciferase בדילול של אחד עד חמישה עם מים deionized ולהפשיר את הכרכים הדרושים של חיץ ריגנט A ו reagent B מההערכה.
כאשר הריאגנטים מוכנים, החלף את העל-טבעי בכל באר ב-75 מיקרוליטרים של חיץ תיזה פסיבי ודגירה של הצלחת במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם רעידות מזדמנות. במהלך הדגירה, לדלל את מצע 50X reagent B מהערכה לריכוז של אחד עד 50 עם חיץ ריגנט B מופשר. בסוף הדגירה, מוסיפים 30 מיקרוליטרים של מאגר תזה פסיבי לארבע בארות בקרה ריקות ומעבירים 30 מיקרוליטרים של ליאזט מכל באר לתוך בארות כפולות של צלחת בדיקה לבנה תחתונה שטוחה 96 היטב.
כאשר כל הליזט כבר מצופה, להשתמש פיפטה רב ערוצית להוסיף 50 microliters של reagent A לכל באר ולקרוא את אות לוציפראז גחלילית עם קורא צלחת. לאחר מכן השתמש פיפטה רב ערוצית להוסיף 50 microliters של reagent B לכל באר ולקרוא את האות רנילה לוציפראז עם קורא צלחת. כצפוי, YAP2SA מגבירה את פעילות גחלילית לוציפראז אך לא את פעילות רנילה לוציפראז בהשוואה לווקטור הבקרה.
לעומת זאת, YAP2SA S94A אינו מגביר את פעילות גחלילת לוציפראז. חשוב לציין, YAP2SA אינו משנה את הפעילות של מבנה מקדם מינימלי חסר אלמנטים מחייבים MCAT TEAD. בתאים מומרים עם מבנה הכתב YAP-TAZ-TEAD, סיכות ראש קצרות YAP ו- TAZ הפחיתו באופן משמעותי את רמות לוציפראז גחליל אש, אבל בקרת סיכת ראש קצרה שליטה ללא מיקוד לא.
לעומת זאת, בתאים מנוגדים עם מבנה הכתב המינימלי, RNA סיכת ראש קצרה YAP-TAZ אינו משנה באופן משמעותי את רמות לוציפראז גחליל אש. אות רנילה בכל באר גם לא השתנה באופן משמעותי על ידי בקרת סיכת ראש קצרה ללא מיקוד או RNA סיכת ראש קצרה YAP-TAZ. כצפוי, RNAs סיכת ראש קצרה מיקוד YAP ו TAZ, SARC או PI3 קינאז מפחית באופן משמעותי את פעילות YAP-TAZ-TEAD.
RNAs סיכת ראש קצרה מיקוד כספומט, CDH1, CSK, ERBB2, וג'לזלין כל גדל רמות לוציפראז גחליל מנורמל עולה בקנה אחד עם מחקרים שפורסמו מראה כי חלבונים אלה היו YAP ו / או TAZ. למרות תפקידים הוקמה עבור ATR, CCNE2, ו ERBB4 בסוגי תאים אחרים, RNAs סיכת ראש קצרה מיקוד גנים אלה אינם משנים באופן משמעותי רמות לוציפראז גחליל נורמלי בתאי A375. בעקבות מסך זה, יש לאמת את זיהוי הרגולטורים באמצעות קריאות אחרות עבור פעילות גורם התמלול שלהם.
יש לאשר גם הפלה אפקטיבית של הרגולטור שזוהה על ידי ההסתה. זכור לנקוט זהירות ולעקוב אחר הנחיות בטיחות בעת עבודה עם lentiviruses זיהומיות, במיוחד אם הנגיפים הם זיהומיות אנושיות.
